幼虫淋巴腺解剖：分离 Drosophila 血细胞生成器官

摘要

来源：Reimels, T. A. 和 Pfleger, C. M. 检测果蝇幼虫淋巴腺及血细胞的方法. J. Vis. Exp. (2016)。

本视频介绍了果蝇幼虫中造血的主要部位——Drosophila 淋巴腺，并演示了一种用于免疫组织化学和荧光成像的器官解剖与制片示例方案。

方案

本方案节选自 Reimels 和 Pfleger 的《检测淋巴腺与血细胞的方法》 黑腹果蝇 幼虫， 视频实验杂志 (2016).

1. 幼虫淋巴腺免疫组织化学

注意： 淋巴腺位于幼虫前端约三分之一长度处，背侧，略低于脑部。（见图1B中的箭头。）淋巴腺位于背血管两侧，最易连同口钩或脑部一起解剖下来。野生型三龄幼虫的淋巴腺结构非常小，主叶长度约为100 - 200 µm。（见图2A。）

1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，需限制卵的收集时间，仅让雌虫产卵2至6小时。
2. 淋巴腺解剖
   1. 每种实验条件下，加入 1 ml 1× PBS（表124 孔板的一个孔中。
   2. 加入1滴0.1% PBST（表1使用一次性移液管向每个孔中加入）
      注意： 加入去垢剂（如 Tween 20）以降低表面张力，使组织沉降至孔板底部。
   3. 将培养皿平放在冰上。
   4. 在盛有1×PBS的解剖培养皿孔中收集幼虫。
   5. 将一块干净的解剖垫放置在透射光体视显微镜载物台上。使用一次性移液管滴加数小滴0.01% PBST表1) 上。将一条幼虫转移至一滴PBST中以进行解剖。
   6. 用一对镊子夹住幼虫，位置在距后端约四分之一体长处，背面向上。
   7. 使用另一把镊子夹住紧邻夹持幼虫的镊子前方的角质层。轻轻将角质层向前端拉动，直至口钩暴露。
      注意： 目的是在不破坏任何内部结构的情况下剥离角质层。
   8. 松解角质层，用两把镊子将幼虫剪成两段。将后段从PBST液滴中移除。
      注意： 如果角质层未完全剥离至口钩处，可将幼虫切成两段，并移除后半部分。用一对镊子夹住角质层边缘，另一对镊子将口钩从开口处推出。此操作可使角质层内翻，从而暴露口钩。该方法也可作为替代解剖方案使用。
   9. 使用一对镊子固定外骨骼（腹侧外骨骼、背侧外骨骼瓣膜，或两者同时固定）以保持稳定。
   10. 使用另一把镊子夹住暴露的口钩，并轻轻将其拉出。
       注意： 这将使表皮与内部结构分离。理想情况下，复眼/触角成虫盘、脑、环状腺以及沿背血管两侧分布的淋巴腺将保留在口钩上。
   11. 在仍持住口钩的同时，小心去除唾液腺、脂肪体和肠等不需要的结构。
       注意： 如果脑部与口钩分离，淋巴腺可能仍附着在脑部并随其一同被采集。此时应握住腹神经索而非口钩。
   12. 以口钩或腹神经索作为抓手，将解剖得到的包含淋巴腺的复合体转移至冰上的孔中。 固定前不得超过30分钟。
3. 固定与免疫组织化学
   1. 将24孔板放置在体视显微镜载物台上。
   2. 使用 p200 移液器小心地从孔中移除 PBST。
      注意： 空的相邻孔可用于临时放置废弃物。
   3. 轻轻加入 200 µl 3.7% 甲醛（表1沿孔壁加入液体并轻轻摇晃培养板，以确保已解剖的组织完全浸没。
   4. 将培养板放回冰上孵育30分钟。若淋巴结表达荧光蛋白，需将培养板保持遮盖状态，以防止荧光淬灭。
   5. 使用 p200 移液器小心移除固定液。
   6. 加入 200 µl 1× PBS 至孔中，将板置于室温下振荡器上孵育 5 分钟进行洗涤。使用 p200 移液器小心吸除 PBS。
      注意： 固定的淋巴腺可在 PBS 中冰上保存，直至所有实验条件下的淋巴腺均完成解剖和固定。
   7. 重复洗涤步骤两次。
   8. 加入200 µl透化溶液（表1)加入孔中，将培养板置于室温下振荡孵育45分钟。
      注意： 45 分钟是 "金标准" 用于淋巴腺通透化，但作者仅在20分钟后即获得成功。
   9. 用 p200 移液器吸除溶液。
   10. 用抗体稀释液稀释一抗（表1根据供应商说明书操作。向孔中加入 300 µl 一抗溶液，确保所分离的组织完全浸没。4 °C 下孵育过夜。
   11. 使用 p200 移液器移除一抗。
   12. 加入 200 µl 1x PBS 到孔中，将板置于室温下振荡摇床上震荡洗涤 10 分钟。使用 p200 移液器小心吸除 PBS。
   13. 重复洗涤步骤两次。
   14. 根据供应商说明书，用抗体溶液稀释二抗。向孔中加入300 µl二抗溶液，确保所分离的组织完全浸没。在室温下于摇床中孵育至少2小时。
   15. 使用 p200 移液器去除二抗，并按照步骤 1.3.12 中所述进行洗涤 & 1.3.13. 最后一次洗涤后不要移除PBS。
4. 淋巴腺组织封片
   1. 使用70%乙醇清洁玻璃显微镜载玻片（表1）和组织擦拭纸。
   2. 每种实验条件下，放置一滴封片缓冲液（表1)置于载玻片上。
      注意： 一张载玻片可容纳两个样本。封片缓冲液体积取决于待封片的淋巴腺数量：约18-20个淋巴腺使用2 µl，10-12个使用1 µl，5个或更少使用0.5 µl。
   3. 将显微镜载玻片置于透射光源体视显微镜的载物台上。
   4. 每次最多针对两种条件，用镊子夹住淋巴腺的口钩或腹神经索作为手柄，将其从孔中全部转移至封片缓冲液中。
   5. 将解剖后的组织均匀地排列成圆形或矩形，在此过程中铺开封片缓冲液。
   6. 对于每一份分离的组织，用镊子的一个尖端从腹血管下方插入，并轻轻向封片缓冲液的边缘拉动。
      注意： 这将使淋巴腺从其他解剖组织中分离出来，并将其在玻璃表面展平。
   7. 用镊子的一侧钳尖，以锯切动作切断位于淋巴腺与脑之间的背血管。
   8. 将剩余的解剖组织移至淋巴腺对侧，位于缓冲液最外缘处。
      注意： 不需要的已解剖组织最终会围绕淋巴腺形成一圈边缘，可作为支撑物，使盖玻片得以稳定放置。
   9. 重复上述操作，直至所有淋巴腺均从解剖组织中分离，并保留一份不需要的解剖组织置于中央。
   10. 用两根手指夹住盖玻片。检查盖玻片是否无灰尘和指纹。如有必要，可用擦镜纸蘸取70%乙醇清洁盖玻片。
   11. 确保盖玻片边缘与载玻片边缘平行，小心地将盖玻片缓缓覆盖在封片缓冲液上。
       注意： 显微镜载玻片可在成像前于 4 °C 保存。最长保存时间取决于所用抗体的稳定性。24 孔板可冲洗后重复使用。

2. 成像

1. 根据制造商的操作手册，使用适当的标准荧光显微镜或共聚焦显微镜，在20倍或更高放大倍数下对固定的血细胞和安装的淋巴腺进行成像。根据制造商的操作手册，使用标准体视显微镜在2倍放大倍数下对整个幼虫进行成像。
2. 如需进行去卷积，请遵循软件供应商的说明。

结果

图1：体内晶体细胞黑色素化。 A) 加热前将幼虫单独放入PCR管中。红色箭头指示未位于管底的幼虫。 B) 加热后典型的晶体细胞黑色素化模式，有时可显示出淋巴腺（箭头；显示背侧，前端在左侧）。比例尺为1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS 片剂	MP Biomedicals	2810305
解剖皿	Corning	7220-85
微量离心管	Denville	C2170
由 Sylgard 184 试剂盒制备的硅胶解剖垫	Krayden（通过 Fisher 销售）	NC9644388（Fisher 目录编号）	按照生产商说明，将 Sylgard 弹性体试剂盒组分混合后在培养皿中制备而成。
体视显微镜	Morrell Instruments（Nikon 分销商）	mna42000, mma36300	Nikon 型号 SMZ1000 和 SMZ645
擦拭纸	VWR	82003-820
镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 移液器	Eppendorf	3120000054
甲醛	Fisher	BP531-500
吐温-20	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
牛血清白蛋白	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
正常山羊血清	Sigma	G9023-10ML
正常驴血清	Sigma	D9663-10ML
200 证明乙醇	VWR	V1001
没食子酸丙酯	MP Biomedicals	102747
甘油	VWR	EM-4750
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）	Fisher	62248
显微镜盖玻片，18 mm 圆形	Fisher	12-545-100
玻璃显微镜载玻片	Fisher	22-034-980
24 孔板	Corning	351147
一次性移液管	Fisher	13-711-9AM
荧光显微镜	Zeiss		Axio Imager.Z1