Drosophila 成虫脑解剖：果蝇神经生物学中的一种方法

摘要

来源：Kelly, S. M. 等人 成年果蝇蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色 黑腹果蝇 大脑. J. Vis. Exp. (2017).

本视频介绍了如何解剖和分离成年 Drosophila 大脑——这一操作是可视化该器官所必需的步骤，因为大脑通常被外骨骼、眼睛和气管组织遮挡。示例方案详细展示了获得高质量样本的完整过程，这些样本可用于 Drosophila 神经生物学研究中的免疫染色和成像方法。

方案

本实验方案节选自 Kelly et al., 成年 Drosophila melanogaster 脑中蘑菇体与感光神经元的解剖及免疫荧光染色, J. Vis. Exp. (2017)。

1. 解剖工作站准备

1. 将体视显微镜及带有光纤蛇形管的光源放置在较大的实验台面上。为在解剖过程中保持手部动作稳定并减少手部"抖动"，显微镜周围必须留出充足的手部和手臂支撑空间。确保显微镜两侧各留有约8–10英寸的空间，显微镜底座与实验台边缘之间留有4–6英寸的距离。
2. 在玻璃制的9孔或3孔培养皿中，向其中2至3个孔各加入1.0 mL PTN缓冲液（0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.2，含0.1%非离子型表面活性剂；完整缓冲液组分见材料表），并将培养皿置于冰上，靠近解剖操作台。新解剖获得的脑组织将转移至此培养皿中，并在固定前进行储存。
   注意：若需进行活体成像，解剖缓冲液应使用1×磷酸盐缓冲液（PBS）或HL3缓冲液。若需检测细胞内蛋白定位，PBS也可作为解剖和固定步骤的替代缓冲液。固定后，应使用含0.1%或0.3%非离子型去垢剂的PTN缓冲液进行洗涤，以实现细胞膜的通透化处理。
   1. 若使用PBS进行解剖和固定操作，移液器吸头应在转移脑组织至微量离心管前，至少用含去垢剂的缓冲液（如PTN缓冲液）冲洗一次，以防止脑组织粘附在塑料吸头上。
3. 使用一个空的35 mm玻璃或塑料培养皿，制备一个含有硅胶弹性体的解剖皿。具体操作为：按照制造商说明混合弹性体组分，倒入35 mm培养皿中，并在平坦表面上静置过夜使其聚合。使用含硅胶弹性体的解剖皿可保护解剖镊的精细尖端，避免其与较硬表面（如玻璃培养皿）接触而受损。我们亦常规从在线供应商处购买市售的硅胶涂层培养皿。为在解剖过程中提高对比度，含有失活炭粉（因而呈黑色）的硅胶弹性体解剖皿尤为有用。

2. 成年果蝇大脑解剖步骤

1. 麻醉3至5日龄的成年果蝇 D. melanogaster 含 CO₂ 或使用冰进行麻醉。若使用冰，将装有果蝇的离心管倒置（塞子朝下）放入冰桶中约5分钟。将离心管倒置放入冰中可防止果蝇卡在食物中。果蝇麻醉后，将其转移至置于冰上或二氧化碳装置上的冰冷金属板或培养皿中₂ 发射蝇垫。若解剖果蝇大脑以分析神经退行性病变，也可使用较老的果蝇。
2. 使用移液管或P200移液器将少量（150 - 200 µL）PTN置于解剖皿中央，以形成 "气泡" PTN的处理。将解剖皿置于体视显微镜下，调节光源和焦距，使PTN气泡充满整个视野并获得均匀照明。
3. 操纵果蝇，使其处于 "仰卧" (即，腹面朝上）置于金属或CO₂ 垫板
4. 使用一对 #5 镊子夹住待解剖果蝇的腹部，并保持夹持状态，将果蝇完全浸入解剖皿中的 PTN 溶液中。
   注意： 在本方案的其余步骤中，所有操作均应在头部浸没于PTN中的条件下进行。
5. 使用另一把5号镊子夹住果蝇喙的基部，将两把镊子分开，使果蝇头部与身体分离。丢弃腹部和胸部。此步骤中，必须确保头部不被松开，避免其漂浮在PTN溶液表面。一旦头部漂浮，再次夹取将非常困难，且容易压碎脑组织。
   注意： 使用该方法时，脑与腹神经索之间的连接将被切断。若需要保持中枢神经系统这些区域之间的完整连接，则应采用另一种解剖方案。若在移除头部之前口器已从果蝇头部脱落，则口器原位置将留下一个孔洞。此时，应从靠近一侧复眼的孔洞边缘夹住果蝇头部，然后施加适当力度，将两把镊子反向拉开，从而移除头部。有时在将头部从身体分离后，肠道和/或腹神经索仍附着于头部，应在继续解剖前将其清除。
6. 当一对镊子夹住吻部时，另一对镊子应夹住右侧果蝇眼睛的内侧边缘。缓慢地将两对镊子向两侧拉开。此步骤需施加轻微且稳定的横向力。随着镊子缓慢分离，吻部应从头部脱离，并在头壳上形成一个中央孔洞。用第一对镊子将吻部丢弃，同时保持第二对镊子夹住右侧眼睛的内侧部分不松开。
   注意： 成年个体 D. melanogaster 脑位于尾侧（即，果蝇头部的后部/尾部区域。因此，应避免抓握头部的这一区域。理想情况下，仅抓握吻部（即，应使用镊子直接夹住靠近视网膜内侧的头部前部区域。此时，通过外骨骼中央的开口应可观察到脑组织及相连的气管。此时可将从开口处伸出的白色丝状气管组织小心去除并丢弃。
7. 用第二把镊子夹住左视网膜的内侧边缘（位于头壳中央孔洞的边缘处）。为移除视网膜及其附着的头壳组织，缓慢以180°角将镊子向相反方向拉开。当视网膜逐渐与下方的视叶分离时，应能感觉到张力略有减小。操作应缓慢进行，以防止撕裂视叶。
   注意： 此步骤中若过快分开镊子，可能导致视叶撕裂或蘑菇体结构受损。有时外骨骼已被去除，但部分视网膜仍附着在视叶上。若仅对蘑菇体进行成像，完全去除视网膜并非必需。然而，若需分析其他脑区（如视网膜神经元对视叶的支配），则可能需要按所述方法彻底去除视网膜。
   注意： 随着视网膜逐渐从下方的视叶脑组织分离，视叶应呈现为被白色丝状气管覆盖的不透明白色结构。一旦一侧视网膜被移除，即可将其弃去。在分析视网膜神经元投射路径时，此步骤需格外小心，以避免损伤视叶。另有一套专门针对感光神经元的解剖与活体成像的实验方案可供参考。
8. 现在，仔细移除尽可能多的可见气管组织。气管可能已含有或后续会充入空气，导致脑组织上浮，进而在后续免疫染色步骤中可能丢失。为去除气管，使用一对非常锋利的5号镊子将其从脑组织上夹除。
9. 使用两把镊子夹住果蝇左侧视网膜的内侧区域，移除残留的视网膜及周围角质层。小心地将视网膜撕开成两半，以去除视网膜和角质层碎片。在某些情况下，不压碎脑组织而完全清除残留角质层尤为困难。此时，可先用一把镊子夹住残留的腹神经索，再用另一把镊子小心地去除最后残留的角质层。
10. 使用 p200 移液器将解剖得到的脑组织转移至含有 PTN 的 9 孔或 3 孔培养皿中的一个孔内。相同基因型的脑组织应集中放入同一孔中，并置于冰上保存。脑组织应在解剖后一小时内进行固定。若需要较多脑组织，可分批固定后再合并。在大多数情况下，经验丰富的研究人员通常可在约 3 至 5 分钟内完成一个脑组织的解剖并将其转移至玻璃收集皿中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微解剖镊子	Ted Pella	505-NM
聚二甲基硅氧烷（Sylgard）培养皿	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	可从 amazon.com 购买
磷酸二氢钠缓冲液	Sigma	S3139
吐温-100（Triton X-100）	Sigma	X100-100ml
体视显微镜	Leica S6D 配 KL300 LED 光源
9孔板（点样板）	VWR	89090-482
35 mm 培养皿	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
吸水纸（Kimwipe）	Fisher	06-666
PTN 缓冲液			0.1 M NaPhosphate，pH 7.2，0.1% Triton-X-100；通常配制 0.5 L 的 0.1 M NaPhosphate 缓冲液，并根据需要每次分装 50 ml