计数菌落形成单位（CFUs）：从果蝇体内定量细菌

摘要

来源：Koyle, M. L. 等 果蝇的饲养 & 黑腹果蝇 在无菌和已知菌群条件下. 视频实验杂志 (2016).

Drosophila 肠道微生物群影响果蝇的发育、免疫和生理功能。本视频介绍了一种通过测定整体果蝇样本的菌落形成单位来定量果蝇体内细菌的方法。该方案以在无特定病原体条件下饲养并接种四种细菌的果蝇为例，演示了该技术的操作过程。

方案

本实验方案节选自 Koyle 等，无菌和已知菌群条件下培养果蝇 Drosophila melanogaster，《视觉化实验杂志》（J. Vis. Exp.，2016年）。

1. 脱去卵壳并转移至无菌培养基

1. 使用70%乙醇喷洒生物安全柜内部（包括侧面）进行准备。用实验室纸巾擦拭底部，并用紫外灯对操作台灭菌约15分钟。将所有非生物用品（样本杯、毛刷、镊子、废液容器、400 ml无菌水和100 ml 0.6%次氯酸钠溶液）用乙醇喷洒后立即放入生物安全柜中，并用紫外灯灭菌15分钟。
2. 开始第一次0.6%次氯酸钠清洗：将带有卵的套管放入一个120 ml的样本杯或其他无菌容器中。缓慢倒入约90 ml 0.6%次氯酸钠溶液至套管边缘稍下方。
3. 用次氯酸钠溶液冲洗卵2.5分钟。期间使用镊子上下移动套管，定期重新悬浮卵粒。
4. 在生物安全柜内，将套管直接转移至第二个预先装有90 ml漂白剂的样本杯中。
5. 在生物安全柜内重复步骤1.3。第二次漂白处理结束时，卵应开始附着在套管壁上。
6. 在生物安全柜内执行步骤1.7–1.8。
7. 弃去漂白剂，用无菌水清洗套管三次。每次清洗过程中使用镊子移动套管，多次重新悬浮卵粒。第三次清洗结束后，大多数卵应已附着在套管侧壁上。
8. 使用经乙醇灭菌的毛刷，将套管壁上的卵转移到无菌培养基中。可逐个或小批量转移卵，每瓶接种30–50枚卵为宜。瓶盖保持松动，以允许氧气进入。若需维持无菌状态，则将瓶子转移至昆虫培养箱；否则按以下方法添加细菌。

2. 使用4种细菌制备无菌果蝇

1. 制备细菌
   1. 在生物安全柜中准备好灭菌的实验用品（移液器、移液器吸头盒、灭菌离心管、MRS肉汤及试管架），操作同1.1步骤。将试管放入生物安全柜前，先用浸有乙醇的实验室擦拭纸擦拭试管外表面。
   2. 将500 µl过夜培养物转移至无菌微量离心管中，通过离心沉淀细菌。若菌液密度较低，可向每管中加入最多1.5 ml培养物，或依次移除上清液后向同一管中添加额外培养物。将样品移出生物安全柜，于10,000 x g离心10分钟。使用带滤芯吸头以避免样品间交叉污染。
   3. 通过测量OD值确定每种培养物的密度₆₀₀若使用多孔板读数仪，将每种培养物分别以1倍、2倍和4倍稀释度各取200 µl转移至96孔板中。
   4. 使用酶标仪分光光度计和以下公式，确定用于稀释各细胞沉淀（2.1.2）的mMRS培养基体积。需确保加入足量的培养基，以便向每支果蝇培养管中接种50 µl。
      1. 收集 OD₆₀₀ 在平板读数分光光度计上测定每种细菌培养物1:1、1:2和1:4稀释度的读数。为每种细菌菌株选择产生合适OD的稀释度₆₀₀ 在0.1至0.2之间选择一个数值，并将该数值及其对应的稀释倍数分别作为公式2.1.4.2或2.1.4.3中的“O”和“D”。
      2. 若使用本文所述的4种物种，需将细胞归一化至等效的菌落形成单位（CFU）/ml密度（OD₆₀₀ 之前确定的CFU转换 Newell 和 Douglas，Appl Environ Microbiol.（2014） 使用此方程：
         E = ((O-B) × V × D)/C
         其中，E = 重悬沉淀的体积（µl），O = OD₆₀₀ 细菌，B = OD₆₀₀ 空白培养基，D = 稀释倍数，V = 离心前细菌培养物体积（µl），C = OD₆₀₀ 预设的常数。有关使用这些方程进行计算的示例，请参见补充代码文件。对于可自动调零的分光光度计，使用 "O" 代替 "O-B".
         注意： 预设常数（单位OD₆₀₀，归一化至10⁷ CFU/ml^-1，从中推导出的常数 纽维尔和道格拉斯，应用环境微生物学。（2014）如下： A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), 植物乳杆菌 (0.077).
      3. 若使用其他细菌种类（无CFU/OD₆₀₀ 常数可获得时，将密度归一化为OD₆₀₀ = 0.1，使用此方程：
         E = ((O-B) × V × D)/0.1 OD₆₀₀
         注意： 单位与步骤 2.1.4.2 中相同。参见 补充代码文件 有关使用这些方程进行计算的示例。
   5. 在生物安全柜中，用移液器吸头吸除上清液，并根据步骤 2.1.4.2 的计算结果，将沉淀重悬于新鲜的 mMRS 或 PBS 中。
2. 接种细菌
   1. 在生物安全柜中，将50 µl细菌转移至含有无菌饲料和去壳卵的锥形管中。在转移卵后加入细菌，以防止不同瓶之间的污染。
   2. 将接种后的试管置于25 °C培养箱中。

3. 测定菌落形成单位载量/检测无菌性

1. 为测定整个果蝇匀浆液中的菌落形成单位（CFU）载量，将5只果蝇（羽化后5–7天）转移至含有125 µl陶瓷珠和125 µl mMRS肉汤的1.7 ml微量离心管中。使用组织匀浆器以4.0 M/sec的速度匀浆30秒。
   1. 可选方案：省略陶瓷珠，改用塑料研磨杵在微量离心管中手动匀浆1分钟。
   2. 若需定量肠道微生物群，应进行果蝇表面灭菌以去除外源性微生物。将果蝇转移至含有100 µl 70%乙醇的微量离心管中处理1分钟，吸除乙醇后，再将果蝇转移至新的微量离心管中进行匀浆。若需测定肠道DNA含量，则在乙醇洗涤前先用0.6%次氯酸钠溶液冲洗1分钟。
2. 向匀浆液中加入875 µl mMRS，涡旋振荡5秒，然后吸取120 µl匀浆液加入微孔板的第一个孔中。
3. 在接下来的两个孔中，使用10 µl匀浆液和70 µl MRS进行连续两次1:8稀释。
   1. 从第一孔中取出10 µl加入第二孔（含70 µl MRS），充分混匀；再从第二孔中取出10 µl转移至第三孔（含70 µl MRS），并充分混匀。由此可获得原始1,000 µl匀浆液的三种总浓度：未稀释、1:8和1:64。
4. 将每种稀释液各10 µl转移至mMRS平板（可根据需要使用多通道移液器）。轻微倾斜培养皿，使液滴沿琼脂表面向下扩散数毫米，并在移动平板前等待液体干燥。若平板已存放2天，则液体干燥较快，可减少相邻液滴之间的混合。
5. 在30 °C下培养1–2天。当观察到明显且独立的菌落时，从含有10–100个孤立菌落的稀释度平板上进行计数。
6. 使用公式 E = C × D/P × V/F 计算每只果蝇的CFU，其中E为每只果蝇的CFU，C为计数的菌落数，D为稀释倍数，P为点样体积（µl），V为果蝇匀浆液体积，F为匀浆的果蝇数量。

结果

补充代码文件：示例计算。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酿酒酵母	MP Biomedicals, LLC.	903312
葡萄糖	Sigma Aldrich	158968-3KG
琼脂	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% 葡萄汁浓缩液	沃尔玛或其他杂货店	9116196
饲养瓶：32 盎司半透明圆形熟食容器	Webstaurant Store	999L5032Y
半透明圆形熟食容器盖	Webstaurant Store	999YNL500
储存瓶	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
尼龙筛网	Genesee Scientific	57-102
塑料衬套	Home Depot	100404002
塑料衬套盖	Home Depot	100153897
样本杯	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml 离心管	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
食物盒	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D 散装	MP Biomedicals, LLC.	116540434
带滤芯移液器吸头，300 µl	USA Scientific	1120-9810
培养皿	Laboratory Product Sales	M089303
乙醇	Decon Laboratories, INC.	2701
画笔	沃尔玛	5133
镊子	Fisher	08-882
家用漂白剂（6-8% 次氯酸盐）	沃尔玛	550646751
通用蛋白胨	Genesee Scientific	20-260
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	P3786-1KG
柠檬酸铵	Sigma Aldrich	25102-500g
乙酸钠	VWR	97061-994
硫酸镁	Fisher Scientific	M63-500
硫酸锰	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS 粉末	Sigma Aldrich	69966-500G
96 孔板读数仪	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml 离心管	USA Scientific	1615-5500
带滤芯移液器吸头，1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 孔板	Greiner Bio-One	655101
陶瓷珠	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
组织匀浆器	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Ⅰ级生物安全柜	Thermo Scientific	Model 1395