昆虫腿部样本的荧光显微镜制备方法：一种用于成像的神经肌肉结构保存技术

摘要

来源：Guan, W.，等。 可视化 果蝇 成体表皮中的腿部运动神经元轴突. 视频实验杂志 (2018).

本视频介绍了一种解剖、固定和封片的方法 果蝇 在保持神经肌肉结构完整的前提下对成年腿部进行成像分析。

方案

本方案节选自 Guan 等，可视化 果蝇 成年果蝇表皮中的腿部运动神经元轴突 视频实验杂志 (2018).

1. 腿部解剖与固定

1. 取一个玻璃多孔板，在适量的孔中加入70%乙醇。将15–20只经CO₂麻醉的果蝇（性别和年龄不限）放入每个孔中，用毛刷轻轻将果蝇按入乙醇溶液，直至完全浸没。
   注意：此步骤旨在去除表皮的疏水性。清洗时间不得超过1分钟，否则会增加表皮的自发荧光。
2. 用含0.3%非离子表面活性剂的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤果蝇3次，每次至少保留果蝇在此溶液中10分钟。
   注意：加入去污剂有助于更好地固定腿部，可能是因为其可增强固定剂渗入腿部内部。
3. 将一个多孔板置于冰上，并同时准备一管4%多聚甲醛（PFA）。
   注意：使用16%无乙醇PFA储备液新鲜配制4% PFA至关重要。
4. 用镊子去除果蝇的头部和腹部，注意不要损伤胸部节段或腿部。
   注意：去除腹部后更便于抓握果蝇并解剖腿部。
5. 用镊子从胸部节段分离腿部，并将腿部放入含有4% PFA的孔中。操作时，用精细镊子的尖端在基节与胸部连接处轻轻但有力地推动，直至腿部脱落。
6. 在4 °C条件下用4% PFA固定腿部过夜（总计约20小时）。
7. 用含0.3%非离子表面活性剂的1× PBS溶液洗涤腿部，每次20分钟，共洗5次。
8. 将洗涤缓冲液更换为封片介质。在封片前，将腿部在封片介质中至少保存一天，以确保介质充分渗透至腿部内部。
   注意：如果封片介质黏度过高，可用1× PBS将其稀释至80%，因为黏度的突然变化可能导致表皮塌陷，破坏腿部整体结构。根据所使用的Gal4驱动系，果蝇在封片介质中可在4 °C保存1至3周，直至进行封片。

2. 腿部固定

1. 在载玻片左侧放置约 20 µL 的 70% 甘油，并用一块 22 × 22 mm² 的方形盖玻片覆盖（图 1A,B）。用移液器沿一条与该盖玻片右侧边缘平行且稍有距离的线，滴加约 10 µL 封片介质。再在载玻片右侧更远的位置添加另外 30 µL 封片介质（图 1C）。
   注意： 当将盖玻片覆盖在腿样组织上时（见下文），封片介质会轻柔地在盖玻片下方及腿周围扩散，而不会移动其位置。
2. 使用精细镊子将腿从溶液中提起，并轻轻放置在靠近左侧盖玻片的封片介质上。对每条腿重复此操作，并自上而下依次排列整齐（图 1D）。
   1. 将腿夹在镊子尖端之间的一滴介质中进行提起和转移。腿的朝向可有两种：外侧朝上或朝下。
3. 当所有腿（最多可固定 6–8 条）均正确排列后，将第二块盖玻片覆盖在腿上方，使该盖玻片轻微搭在先前放置的盖玻片上（图 1E），以在盖玻片与组织之间留出空间，防止腿受到损伤（图 1G）。
   注意： 也可使用贴片式小室或正畸蜡在盖玻片与载玻片之间创建间隙。
4. 用指甲油在每个角落固定盖玻片的位置（图 1F）。
   注意： 组织现在已准备好进行成像。

结果

图1：在显微镜载玻片上安装足部标本的步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Fisher	E/6550DF/17	分析纯级
非离子型表面活性剂去垢剂	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100，分子生物学用
精细镊子	Sigma-Aldrich	F6521	珠宝镊，Dumont No. 5
玻璃多孔板	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9孔Pyrex板，100 mm × 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% 甲醛（w/v），无甲醇
甘油	Fisher BioReagents	BP 229-1	甘油（分子生物学级）
间隔垫片	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer，四孔，每孔工作体积约12 μL，直径7 mm，深度0.18 mm
22 mm × 22 mm 方形盖玻片	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-厚度0.16 至 0.19 mm
封片介质	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield 抗荧光淬灭封片介质