用于荧光显微镜的昆虫腿处理:一种保留神经肌肉结构以进行成像的方法

此协议摘自 Guan 等人，通过成人角质层可视化果蝇腿部运动神经元轴突，J.（2018 年）。

1. 腿部解剖和固定

1. 取玻璃多孔板，用 70% 乙醇填充适量的孔。向每个孔中加入 15-20 只 CO₂ 麻醉果蝇（任何性别和任何年龄），并使用刷子将果蝇轻轻浸入乙醇溶液中><，直到果蝇完全浸没。 注意:此步骤是去除角质层的疏水性。洗涤时间不要超过 1 分钟，因为这会增加角质层的自发荧光。
2. 用 0.3% 非离子表面活性剂洗涤剂溶液在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中冲洗果蝇 3 次。将苍蝇在这种溶液中放置至少 10 分钟。
   注意:使用清洁剂时，腿部固定效果更好，这可能会增加固定剂在腿部内的渗透。
3. 将多孔板与一管 4% 多聚甲醛 （PFA） 一起放在冰上><。 注意:从 16% PFA 无乙醇储备液中制备新鲜的 4% PFA 至关重要。
4. 用镊子去除苍蝇的头部和腹部，而不会损坏胸段或腿部。
   注意:切除腹部更容易握住苍蝇和解剖腿部。
5. 用镊子从胸段解剖腿部，并将腿部放入含有 4% PFA 的孔中。为此，使用细镊子的尖端轻轻但坚定地推动髋胸交界处，直到腿部分离。
6. 将腿在 4% PFA 中于 4 °C 下固定过夜（总共约 20 小时）。
7. 用 0.3% 非离子表面活性剂洗涤剂溶液在 1x PBS 中清洗腿部，每次 5 次，每次 20 分钟。
8. 用封固剂更换洗涤缓冲液。安装前，请将脚腿放在安装介质中至少一天，以便其完全渗透到脚下><。 注意:如果封固剂是高粘度的，请用 1x PBS 将封固剂稀释至 80%，因为粘度的突然变化会导致角质层塌陷并损坏腿部的整体结构。根据 Gal4 驱动程序，苍蝇可以在 4 °C 下在封片剂中保存 1 至 3 周，直至封片。

2. 腿部安装

1. 将大约 20 μL 的 70% 甘油放在显微镜载玻片的左侧，并盖上 22 x 22 mm² 的方形盖玻片（图 1A、B）。沿平行于该盖玻片右边缘的线移液约 10 μL 封固剂。在载玻片的右侧再添加 30 μL 封固剂（图 1C）.
   注意:当在支腿上涂上盖玻片时（见下文），封固剂将在盖玻片下方和支腿周围轻轻扩散，而不会移位。
2. 使用细镊子将腿从溶液中提起，然后轻轻地将其放在左盖玻片附近的安装介质上。对每条腿做同样的事情，并从上到下对齐它们（图 1D）。
   1. 将腿抬起并转移在镊子两个尖端之间的一滴介质中。以两种方式调整支腿的方向:外侧向上或向下。
3. 一旦所有支腿（最多可安装 6-8 个支腿）都正确对齐，将第二个盖玻片放在支腿上，使该盖玻片稍微放在先前放置的盖玻片上图 1E，以便在盖玻片和组织之间留出空间并防止支腿损坏（图 1G）
   注意:或者，使用贴纸井或正畸蜡在盖玻片和载玻片之间留出空间。
4. 使用指甲油固定每个角的盖玻片位置（图 1F）.
   注意:组织现在可以成像了。

图 1:在显微镜载玻片上安装支腿的程序。请点击这里查看此图的较大版本。