固定样品的制备 果蝇 用于免疫染色的卵母细胞：一种高效固定并去除外膜的方法

摘要

来源：Radford, S. J., McKim, K. S. 在固定处理的 Drosophila 卵母细胞中对减数第一次分裂前中期和中期进行成像的技术。J. Vis. Exp. (2016)。

果蝇 晚期卵母细胞的免疫染色由于卵母细胞周围存在膜结构，可能具有较大挑战性。本视频介绍了一种高通量获取卵母细胞、固定卵母细胞并去除其膜结构以进行免疫染色的方法。该方案以用于观察减数分裂不同阶段的晚期卵母细胞为例，展示了这些技术的操作过程。

方案

本方案节选自 Radford 和 麦凯姆 固定样品中减数分裂I期早中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞， J. Vis. Exp. (2016).

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。果蝇培养和杂交使用控温培养箱维持指定温度，除非另有说明。

1. 准备工作

1. 准备果蝇。
   1. 富集分裂前期的卵母细胞收集。
      1. 从健康且年轻的纯系或杂交培养瓶中清除成年果蝇，在25 °C下培养两天。
         注意：通常两个健康的培养瓶已足够，但对于某些杂交培养可能需要更多。
      2. 两天后，从培养瓶中收集约100至300只雌蝇（此时雌蝇年龄为0至2天）。雌蝇无需为处女蝇。在小管壁一侧加入少量酵母糊，每管放入30只雌蝇和10至15只雄蝇。在25 °C下继续培养两天。
   2. 富集分裂中期的卵母细胞收集。
      1. 从纯系或杂交培养中收集约100至300只雌蝇。在小管壁一侧加入少量酵母糊，每管放入30只雌蝇（不加雄蝇）。在25 °C下培养三至五天。
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结果

药物	溶剂	储存浓度	终浓度	处理时间	作用效果
colchicine	ethanol	125 mM	150 µM	10 min 或 30 min	破坏动粒外微管（10 min） 或全部微管（30 min）
paclitaxel	DMSO	10 mM

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 甲醛	Ted Pella, Inc.	18505	危险；开启后一个月内丢弃
250 ml 烧杯	Various
5 ml 离心管	Various
活性干酵母	Various		与水混合制成类似花生酱质地的糊状物
Binucleine 2	Sigma	B1186	危险
搅拌器	Various
牛血清白蛋白	Sigma	A4161
氯化钙	Various
秋水仙素	Sigma	C-9754	危险
盖玻片	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
乙醇	Various
镊子	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont 高精度 5 号镊子
载玻片	VWR	48312-003
葡萄糖	Various
HEPES	VWR	EM-5330	可从多家供应商获得
氯化镁	Various
大孔筛网（~1,500 µm）	VWR	AA43657-NK	多种规格及其他供应商，如 12 或 14 目
小孔筛网（~300 µm）	Spectrum labs	146 424	多种规格，例如 146 422 或 146 486
旋转混合仪	Various
巴斯德吸管	Various
乙酸钾	Various
二甲胂酸	Sigma	C0125	危险；也可用二甲胂酸钠替代
氢氧化钾	Various
乙酸钠	Various
氢氧化钠	Various
蔗糖	Various
紫杉醇（paclitaxel）	Sigma	T1912	危险
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
涡旋振荡器	Various