固定样品的制备 果蝇 用于免疫染色的卵母细胞：一种高效固定并去除外膜的方法

摘要

来源：Radford, S. J., McKim, K. S. 在固定处理的 Drosophila 卵母细胞中对减数第一次分裂前中期和中期进行成像的技术。J. Vis. Exp. (2016)。

果蝇 晚期卵母细胞的免疫染色由于卵母细胞周围存在膜结构，可能具有较大挑战性。本视频介绍了一种高通量获取卵母细胞、固定卵母细胞并去除其膜结构以进行免疫染色的方法。该方案以用于观察减数分裂不同阶段的晚期卵母细胞为例，展示了这些技术的操作过程。

方案

本方案节选自 Radford 和 麦凯姆 固定样品中减数分裂I期早中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞， J. Vis. Exp. (2016).

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。果蝇培养和杂交使用控温培养箱维持指定温度，除非另有说明。

1. 准备工作

1. 准备果蝇。
   1. 富集分裂前期的卵母细胞收集。
      1. 从健康且年轻的纯系或杂交培养瓶中清除成年果蝇，在25 °C下培养两天。
         注意：通常两个健康的培养瓶已足够，但对于某些杂交培养可能需要更多。
      2. 两天后，从培养瓶中收集约100至300只雌蝇（此时雌蝇年龄为0至2天）。雌蝇无需为处女蝇。在小管壁一侧加入少量酵母糊，每管放入30只雌蝇和10至15只雄蝇。在25 °C下继续培养两天。
   2. 富集分裂中期的卵母细胞收集。
      1. 从纯系或杂交培养中收集约100至300只雌蝇。在小管壁一侧加入少量酵母糊，每管放入30只雌蝇（不加雄蝇）。在25 °C下培养三至五天。
2. 配制溶液。
   注意：除非特别说明，溶液可在室温下长期保存。
   1. 配制改良Robb's缓冲液（5倍浓度）：500 mM HEPES、500 mM 蔗糖、275 mM 醋酸钠、200 mM 醋酸钾、50 mM 葡萄糖、6 mM 氯化镁和5 mM 氯化钙。使用10 N 氢氧化钠:氢氧化钾（11:8）调节pH至7.4。过滤除菌，勿高压灭菌。储存于-20 °C。根据需要解冻，用于每次卵母细胞制备时配制约200 ml的1倍浓度Robb's缓冲液。
   2. 固定液配制。
      1. 方案一：配制甲醛/正庚烷固定液。配制固定缓冲液：1倍磷酸盐缓冲液（PBS）加150 mM 蔗糖。使用时，每份卵母细胞制备需新鲜配制，含687.5 µl固定缓冲液和312.5 µl 16%甲醛。
         注意：在通风橱中操作甲醛溶液时需佩戴手套。废弃物应按照机构规定处理。
      2. 方案二：配制甲醛/卡可基酸盐固定液。配制固定混合液（Fix Mix）：250 mM 蔗糖、100 mM 醋酸钾（pH 7.5）、25 mM 醋酸钠（pH 7.0）和25 mM EGTA（pH 8.0）。使用时，每份卵母细胞制备需新鲜配制，含400 µl Fix Mix、100 µl 卡可基酸钾（1 M，pH 7.2）和500 µl 16%甲醛。
         注意：卡可基酸钾含砷元素。
   3. 配制PBS/Triton X-100：1倍PBS加1%或0.05% Triton X-100。储存于4 °C。
   4. 配制PBS-吐温20-牛血清白蛋白（BSA）（PTB）：1倍PBS、0.5% BSA（w/v）和0.1%吐温20。可在4 °C保存一周。

2. 晚期阶段的收集 黑腹果蝇 卵母细胞

1. 由于完整细胞膜的 Drosophila 卵母细胞会黏附于塑料和玻璃表面，因此需使用 PTB 预先涂覆每份卵母细胞样品所需的一个 5 ml 离心管和一支巴斯德吸管的内壁。
2. 用二氧化碳麻醉约 100 至 300 只饲喂过酵母的果蝇，并将其加入含有约 100 ml 1× Robb's 缓冲液的搅拌器中，脉冲搅拌三次（每次约 1 秒）。将卵母细胞置于 Robb's 缓冲液中不超过 <20 分钟，以避免激活。
   注意：也可通过手工解剖雌蝇获取卵母细胞。该方法的优势在于所需雌蝇数量较少。但必须注意将二氧化碳暴露时间限制在几分钟内，以避免缺氧引起的假象。
3. 通过大孔径滤网（约 1,500 µm）过滤至 250 ml 烧杯中，以去除较大的组织碎片。若滤网上残留较多完整的腹部组织，则使用额外的 Robb's 缓冲液重新研磨材料并再次过滤。静置约 2 分钟后，吸除上层液体，尽可能去除大块组织碎片。
4. 通过小孔径滤网（约 300 µm）过滤至另一个 250 ml 烧杯中。使用额外的 Robb's 缓冲液和涂覆过的巴斯德吸管将残留的卵母细胞从第一个烧杯中冲洗出。静置约 3 分钟，使卵母细胞沉降；吸除上清液，仅保留约 10 ml。
5. 将上述约 10 ml 悬浮液尽可能倒入已涂覆的 5 ml 离心管中，待其沉降后吸除液体，并对剩余部分重复此操作。使用额外的 Robb's 缓冲液和涂覆过的巴斯德吸管将烧杯中残留的卵母细胞冲洗至该离心管中。在 5 ml 离心管中静置约 3–5 分钟。

3. 药物处理（可选）

1. 为每份卵母细胞样品准备另一支5 ml试管，并用PTB包被。根据每份卵母细胞样品，在1 ml Robb's溶液中加入适量溶剂（对照）或药物（表1）。
2. 将卵母细胞分装至第二支已包被的5 ml试管中。静置后移除上清液，向其中一支试管加入1 ml Robb's溶液加溶剂，向另一支试管加入1 ml Robb's溶液加药物。根据药物处理所需时间进行温和振荡孵育（表1）。静置沉淀。

4. 固定

1. 吸去所有液体，并立即加入 1 ml 固定液。
2. 方案 #1：甲醛/庚烷固定（固定缓冲液加 5% 甲醛）。
   1. 在振荡器上固定 2.5 分钟。加入 1 ml 庚烷，涡旋震荡 1 分钟。静置约 1 分钟。
   2. 吸去所有液体，然后加入 1 ml 1× PBS。涡旋震荡 30 秒。静置约 1 分钟。
   3. 吸去所有液体，然后用 1× PBS 充满离心管。
      注意：卵母细胞可立即使用，或在室温下置于振荡器上保存数小时。
3. 方案 #2：甲醛/卡可基酸盐固定（固定混合液加 8% 甲醛和 100 mM 卡可基酸盐）。
   1. 在振荡器上固定 6 分钟。静置 2 分钟。吸去液体，然后用 1× PBS 充满离心管。
      注意：卵母细胞可立即使用，或在室温下置于振荡器上保存数小时。

5. 去除膜结构（"滚动"）

1. 使用包被的巴斯德吸管，将约 500 至 1,000 个卵母细胞加入到玻璃载玻片的磨砂（喷砂）区域。用镊子去除所有身体组织和其他多余物质。切勿让卵母细胞干燥；必要时添加 1× PBS。
2. 将盖玻片置于卵母细胞上方，轻轻"滚动"卵母细胞，直至所有膜结构被去除（用盖玻片边缘在卵母细胞上拖动效果最佳）。定期在显微镜下检查操作进展，必要时补充更多 1× PBS。注意力度，过大的压力会破坏卵母细胞。

结果

药物	溶剂	储存浓度	终浓度	处理时间	作用效果
colchicine	ethanol	125 mM	150 µM	10 min 或 30 min	破坏动粒外微管（10 min） 或全部微管（30 min）
paclitaxel	DMSO	10 mM

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 甲醛	Ted Pella, Inc.	18505	危险；开启后一个月内丢弃
250 ml 烧杯	Various
5 ml 离心管	Various
活性干酵母	Various		与水混合制成类似花生酱质地的糊状物
Binucleine 2	Sigma	B1186	危险
搅拌器	Various
牛血清白蛋白	Sigma	A4161
氯化钙	Various
秋水仙素	Sigma	C-9754	危险
盖玻片	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
乙醇	Various
镊子	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont 高精度 5 号镊子
载玻片	VWR	48312-003
葡萄糖	Various
HEPES	VWR	EM-5330	可从多家供应商获得
氯化镁	Various
大孔筛网（~1,500 µm）	VWR	AA43657-NK	多种规格及其他供应商，如 12 或 14 目
小孔筛网（~300 µm）	Spectrum labs	146 424	多种规格，例如 146 422 或 146 486
旋转混合仪	Various
巴斯德吸管	Various
乙酸钾	Various
二甲胂酸	Sigma	C0125	危险；也可用二甲胂酸钠替代
氢氧化钾	Various
乙酸钠	Various
氢氧化钠	Various
蔗糖	Various
紫杉醇（paclitaxel）	Sigma	T1912	危险
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
涡旋振荡器	Various