绒毛膜和卵黄膜机械去除:一种制备用于直接观察的果蝇卵母细胞的方法

该协议摘自 Perkins 和 Bickel，使用荧光原位杂交 （FISH） 监测前中期和中期 I 果蝇卵母细胞中的手臂凝聚状态，J. Vis. Exp. （2017）。

1. 去除绒毛膜和卵黄

注意:有关所需的工具，请参见图 1。

1. 分离晚期卵母细胞
   1. 将 1 mL PBSBTx 添加到浅解剖皿中。使用带有 BSA 涂层尖端的 P200 将固定卵巢 （~150 μL） 转移到浅培养皿中。用 BSA 涂层移液器吸头上下移液卵巢，以将成熟卵母细胞从不太成熟的卵母细胞中移出。
   2. 当晚期卵母细胞充分分离时，将所有组织转移到 500 μL 微量离心管中。用拉动的巴斯德移液管去除多余的液体，在试管中留下约 150 - 200 μL。对剩余的基因型重复第 1.1 节。
2. 准备滚动
   1. 用 200 μL PBSBTx 预润湿深孔培养皿。盖上盖子，放在一边。获得 3 张磨砂载玻片，将载玻片 #3 放在一边。轻轻地将载玻片 #1 和 #2 的磨砂玻璃区域摩擦在一起。用去离子水冲洗它们以去除任何玻璃碎片并用一次性湿巾擦干。
   2. 通过向一张载玻片中添加 50 μL PBSBTx 并用另一张载玻片摩擦该区域，用 PBSBTx 包被载玻片 #1 和 #2 的磨砂区域。用一次性湿巾擦去液体。
   3. 将载玻片放在解剖显微镜下，按照 图 2A.保持载玻片 #1 和 #2 的磨砂区域接触，载玻片 #3 支撑载玻片 #2。
3. 滚动卵母细胞;确保滚动方向始终在直线上，而不是圆周运动。
   1. 在 PBSBTx 中预润湿 P200 移液器吸头，并通过上下移液将卵母细胞分散在微量离心管中。将 50 μL 含有卵母细胞的液体转移到载玻片 #1 的磨砂玻璃部分的中心。抬起幻灯片 #2 来执行此作。
   2. 慢慢降低载玻片 #2，直到液体的表面张力在两个磨砂玻璃区域之间形成密封。应该有足够的液体覆盖磨砂区域，但不应有液体渗出。如果液体溢出，请使用拉动的巴斯德移液器去除多余的液体。
   3. 用一只手握住底部载玻片 （#1） 就位，然后用另一只手沿水平方向来回移动顶部载玻片 （#2），保持载玻片 #2 水平并支撑在载玻片 #3 上。在显微镜下进行，以便轻松观察卵母细胞的运动和进展。
      注意:这种运动会产生摩擦并导致卵母细胞"滚动"并失去绒毛膜。应使用最小压力，动作应短促。
   4. 在水平方向上移动几次后，稍微改变移动的角度（图 2B）。以多个增量逐渐将此角度增加到 90°，直到顶部滑块 的运动垂直于起始方向（图 2B）。请注意，在液体中可以看到空的绒毛膜，而缺乏绒毛膜的卵母细胞会显得更长更薄。
   5. 重复步骤 1.3.3 - 1.3.4 约 7 - 10 次，直到溶液略微浑浊。当大多数卵母细胞 （75 - 85%） 似乎已经失去了卵黄膜时，停止滚动><。 注意:在缺乏卵黄膜的卵母细胞上通常可以看到一个独特的尖头。卵黄膜比绒毛膜更难去除。滚动时，可以对顶部载玻片（载玻片 #2）施加轻微的压力，以去除卵黄膜。试图去除所有卵母细胞中的卵黄细胞膜通常会导致其他卵母细胞的破坏。
   6. 轻轻提起顶部载玻片 （#2），将其一个角拖到底部载玻片 （#1） 的磨砂区域的中心，使滚动的卵母细胞积聚在磨砂区域的中心。用 PBSBTx 将两张载玻片上的卵母细胞冲洗到含有 PBSBTx 的深孔培养皿中。
   7. 用超纯水清洁载玻片 #1 和 #2，用一次性湿巾擦干，然后重置。重复步骤 1.3.1 - 1.3.6，直到相同基因型的所有卵母细胞都已滚动。这通常需要每个基因型 3 - 4 轮滚动。
4. 滚动后清除碎屑
   1. 将 1 mL PBSBTx 添加到 15 mL 锥形管中。旋转液体以覆盖管的侧面。
   2. 使用 PBSBTx 涂层的 P1000 移液器吸头，将卷起的卵母细胞从深孔培养皿转移到含有 1 mL PBSBTx 的锥形管中。将额外的 2 mL PBSBTx 添加到含有卵母细胞的锥形管中。
   3. 让卵母细胞开始沉降到底部，然后用 P1000 去除顶部 2 mL 含有碎片（绒毛膜、卵黄蛋白等）的溶液并丢弃。如果需要，将锥形管放在深色背景上，以便在不透明卵母细胞下沉时看到它们。
   4. 向卵母细胞中再添加 2 mL PBSBTx，然后重复步骤 1.4.3。重复 1.4.3。总共 3 轮碎屑清除。
   5. 使用 PBSBTx 涂层的 P1000 移液器吸头，将卵母细胞转移回原来的 500 μL 微量离心管中。20 - 25 只雌性应产生约 50 μL 的成熟卵母细胞卷起。
5. 使用新鲜的磨砂载玻片、干净的深孔板和每个基因型的新锥形管对剩余的基因型重复第 4 部分。
6. 如果需要储存，将卵母细胞转移到含有 0.1% TritionX-100 的 1x PBS 中，并在 4 °C 下储存过夜。不建议长期储存，因为甲醛交联可以被非离子去污剂逆转。

图 1:细胞学工具。方案中使用的工具:（1） 对镊子 （#5 Dumont）;（2） 钨针;（3） 带盖深井盘;（4） 浅玻璃解剖皿;（5） 拉动巴斯德移液管。请点击这里查看此图的较大版本。

图 2:用于滚动卵母细胞的载玻片的排列和移动。（A） 如方案中所述，用于滚动卵母细胞的载玻片示意图。较暗的区域表示载玻片的磨砂玻璃部分。（B） 卵母细胞滚动过程中载玻片 #2 的运动矢量方向。请点击这里查看此图的较大版本。