绒毛膜和卵黄膜的机械去除：一种制备方法 黑腹果蝇 用于直接观察的卵母细胞

摘要

来源：Perkins, A. T., Bickel, S. E. 使用荧光技术 原位 利用杂交（FISH）监测早中期和中期I染色体臂的黏连状态 果蝇 卵母细胞. 视频实验杂志 (2017).

本视频介绍了一种机械去除经固定处理的成熟卵膜及卵黄膜的方法 果蝇 卵母细胞。本方案详细展示了获得适用于荧光成像的卵母细胞的操作步骤。 原位 杂交实验

方案

本方案节选自Perkins和Bickel的《使用荧光》 原位 通过荧光原位杂交（FISH）监测早中期和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞， 视频实验杂志. (2017).

1. 去除卵膜和卵黄膜

注意：所需工具请参见图1。

1. 分离晚期卵母细胞
   1. 向浅解剖皿中加入 1 mL PBSBTx。使用带有经 BSA 包被的枪头的 P200 移液器，将固定后的卵巢（约 150 µL）转移至浅皿中。用经 BSA 包被的移液枪头将卵巢轻轻吹打，使成熟卵母细胞与未成熟卵母细胞分离。
   2. 当晚期卵母细胞充分分离后，将所有组织转移至一个500 µL微量离心管中。用拉制的巴斯德移液管吸除多余液体，保留约150–200 µL于管中。对剩余的基因型重复步骤1.1。
2. 准备滚压
   1. 用 200 µL PBSBTx 预润湿一个深孔培养皿，盖好后备用。取 3 张磨砂玻片，将第 3 张玻片放置一旁。轻轻将第 1 和第 2 张玻片的磨砂区域相互摩擦。用去离子水冲洗玻片以去除玻璃碎屑，并用一次性擦拭纸擦干。
   2. 用移液枪向1号和2号载玻片的磨砂区域加入50 µL PBSBTx，再将两块载玻片相互摩擦以均匀涂布。随后用一次性擦拭纸吸去液体。
   3. 将载玻片置于解剖显微镜下，按图示配置摆放 图2A保持载玻片#1和#2的磨砂区域相互接触，载玻片#3用于支撑载玻片#2。
3. 滚动卵母细胞；确保滚动方向始终为直线运动，切勿采用环形运动。
   1. 用 PBSBTx 预润湿 P200 移液枪头，通过吹打将微离心管中的卵母细胞分散均匀。取 50 µL 含卵母细胞的液体，转移至载玻片 #1 磨砂玻璃区域的中央。操作时抬起载玻片 #2 进行。
   2. 缓慢降低载玻片#2，直至液体的表面张力在两片磨砂玻璃区域之间形成密封。液体应足以覆盖磨砂区域，但不得有液体渗出。若液体溢出，可用拉制的巴斯德移液管吸除多余液体。
   3. 用一只手固定底部载玻片（#1），另一只手水平来回移动顶部载玻片（#2），同时保持载玻片#2水平并由载玻片#3支撑。操作过程应在显微镜下进行，以便于观察卵母细胞的移动情况和操作进展。
      注意： 这一动作将产生摩擦，从而使卵母细胞 "滚动" 并失去其卵膜。操作时应使用最小压力，动作要短促且迅速。
   4. 水平方向移动几次后，略微改变移动角度（图2B）。分多次逐步将此角度增加至90°，直至顶片（#2）的移动方向与起始方向垂直（图2B注意，空的卵壳会漂浮在液体中，而失去卵壳的卵母细胞则会显得更长且更细。
   5. 重复步骤 1.3.3 - 1.3.4 约 7 - 10 次，直至溶液略微浑浊。当大多数卵母细胞（75 - 85%）似乎已失去其卵黄膜时，停止滚动。
      注意： 缺乏卵黄膜的卵母细胞通常可见一个独特的尖端。卵黄膜比绒毛膜更难去除。在滚动时可对上层载玻片（载玻片#2）施加轻微压力，以帮助去除卵黄膜。试图去除所有卵母细胞的卵黄膜通常会导致其他卵母细胞的破坏。
   6. 轻轻抬起上层载玻片（#2），将其一个角拖向底层载玻片（#1）磨砂区域的中心，使卷曲的卵母细胞聚集在磨砂区域中央。用 PBSBTx 将两片载玻片上的卵母细胞冲洗至盛有 PBSBTx 的深孔培养皿中。
   7. 用超纯水清洁载玻片#1和#2，用一次性擦拭纸擦干，并重置。重复步骤1.3.1至1.3.6，直至完成同基因型的所有卵母细胞滚动。每种基因型通常需要进行3至4轮滚动。
4. 去除滚压后的碎屑
   1. 向一个15 mL锥形管中加入1 mL PBSBTx，轻轻摇动液体以润湿管壁。
   2. 使用经 PBSBTx 包被的 P1000 移液枪头，将深孔培养皿中的卵母细胞转移至含有 1 mL PBSBTx 的离心管中。向含有卵母细胞的离心管中再加入 2 mL PBSBTx。
   3. 让卵母细胞开始沉降至底部，然后移除上层含有碎片（卵丘、卵黄膜等）的2 mL溶液。 等等。用 P1000 吸取并弃去。如有需要，可将锥形管靠在深色背景上，以便观察不透明的卵母细胞下沉。
   4. 加入额外的 2 mL PBSBTx 至卵母细胞中，重复步骤 1.4.3。共重复步骤 1.4.3 三次，以完成总共三轮的去杂质处理。
   5. 使用 PBSBTx 包被的 P1000 移液枪头，将卵母细胞转移回原来的 500 µL 微离心管中。20 至 25 只雌性个体可获得约 50 µL 紧密卷曲的成熟卵母细胞。
5. 对剩余的基因型重复第4步，每种基因型均使用新的磨砂载玻片、洁净的深孔培养皿和新的锥形管。
6. 若需储存，将卵母细胞转移至含0.1% Triton X-100的1×PBS中，4 °C过夜保存。不建议长期储存，因为非离子型去污剂可逆转甲醛交联反应。

结果

图1：细胞学工具。 实验方案中使用的工具：（1）一对镊子（#5 Dumont）；（2）钨针；（3）带盖深孔培养皿；（4）浅底玻璃解剖皿；（5）拉制的巴斯德移液管。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP1600-100	配制10%储存液<br/> 分装后冷冻保存
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS，0.5% BSA，0.1% Triton X-100
镊子	Dumont		#5 INOX，Biologie
9" 一次性玻璃巴斯德吸管	Fisher	13-678-20C	高压灭菌以消毒
浅口玻璃解剖皿			定制
深孔培养皿（3孔）	Pyrex	7223-34
钨针			自制
磨砂玻璃载玻片，25 × 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL 圆底离心管	Various
500 &micro;L 微量离心管	Various
Kimwipes	Various		一次性擦拭纸