角质层破坏法：一种采集血淋巴的方法 黑腹果蝇 幼虫

摘要

来源：Reimels, T. A. 和 Pfleger, C. M. 检查淋巴腺和血细胞的方法 果蝇 幼虫. J. Vis. Exp. (2016).

Drosophila 的血淋巴兼具血液和组织间液的功能，在幼虫和成虫阶段于体内循环。本视频介绍了一种收集幼虫血淋巴以定量循环细胞的实验方案。

方案

本方案节选自 Reimels 和 Pfleger 的研究， 检测淋巴腺与血细胞的方法 果蝇 幼虫， 视频实验杂志 (2016).

1. 循环血细胞浓度

1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，需限制卵的收集时间，使雌虫产卵时间为固定的 2 - 6 小时。
2. 将幼虫收集至盛有 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖培养皿孔中。
3. 对每只幼虫，在冰上放置一支微量离心管，内含 10 µl 1× PBS，并在洁净的解剖垫上滴加 10 µl 1× PBS。将解剖垫置于透射光源的体视显微镜载物台上。
4. 将单个幼虫置于擦拭纸上吸干，再转移至解剖垫上的 PBS 液滴中。
5. 使用一对镊子轻轻撕开并小心翻转表皮，以释放血淋巴。
   注意：操作时应避免刮擦或刺破表皮，以免释放固着型血细胞。
6. 使用移液器从解剖垫上收集血淋巴，避免吸入脂肪体等幼虫碎片。
7. 将收集的血淋巴加入微量离心管中，并通过上下吹打混匀。
   注意：可同时收集多个样本，并在冰上保存最多一小时。
8. 可选：将台盼蓝与血淋巴样本等体积混合，以染色并排除死细胞。加入台盼蓝后需在 3 分钟内完成细胞计数，因其对细胞具有毒性。
9. 在将 10 µl 样本加入血细胞计数板前，先通过上下吹打混匀样本。
10. 若使用自动细胞计数仪，应设置合适的细胞大小和圆度参数。例如，设定最小细胞直径为 2 µm，最大为 22 µm，圆度为 75 - 80%，以检测正常圆形的血细胞。可通过调整不同参数来检测较大或纺锤形的血细胞（如成鞘细胞）。或者，也可使用血细胞计数板进行人工计数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS 片剂	MP Biomedicals	2810305
解剖皿	Corning	7220-85
微量离心管	Denville	C2170
硅胶解剖垫，由 Sylgard 184 试剂盒制备	Krayden（通过 Fisher 销售）	NC9644388（Fisher 目录编号）	按照生产商说明，将 Sylgard 弹性体试剂盒组分混合后在培养皿中制备。
体视显微镜	Morrell Instruments（Nikon 分销商）	mna42000, mma36300	Nikon 型号 SMZ1000 和 SMZ645
组织擦拭纸	VWR	82003-820
镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 移液器	Eppendorf	3120000054
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	C10227
Countess 细胞计数板载玻片	Invitrogen	C10283
血细胞计数板	Hausser Scientific	3200
台盼蓝染液	Life Technologies	T10282