果蝇蛹眼脑复合体的解剖：一种分离视网膜组织的方法

摘要

来源：DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. 解剖 果蝇 用于免疫组织化学、Western 分析和 RNA 提取的蛹期视网膜. 视频实验杂志 (2019).

本视频介绍了如何从黑腹果蝇（Drosophila）蛹中解剖并分离眼-脑复合体。该方案展示了可获得高质量组织的实验步骤，适用于免疫染色以及其他基因表达相关实验。

方案

本方案节选自 DeAngelis 和 Johnson 的《解剖学》 果蝇 用于免疫组织化学、Western 印迹分析和 RNA 提取的蛹期视网膜 视频实验杂志 (2019).

1. 组织制备

1. 设置 Drosophila 杂交（如 Greenspan，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(2004) 中先前所述）或培养特定的 Drosophila 品系，以获得所需基因型的蛹。为确保大量蛹同步羽化，应在营养丰富的培养基或添加了足量酵母糊的标准培养基上重复建立果蝇培养物。
2. 将 Drosophila 培养物维持在 25 °C。对于使用 UAS-GAL4 系统的杂交，GMR-GAL4 是一种理想的驱动子，其在形态发生沟后方的幼虫眼盘细胞中表达，并持续贯穿蛹期发育过程。杂交组合 UAS-lacZ × GMR-GAL4 可作为理想的对照杂交，因其驱动非内源性且无活性的 β-半乳糖苷酶蛋白的表达。
3. 使用已蘸取蒸馏水的 6" 竹签尖端，轻轻从健康培养管壁上挑取白色未成熟蛹（图 1B），并转移至 1.5 mL 微型离心管中（图 1A）（图 1C）。
4. 将微型离心管放入塑料移液器吸头盒中，并放入一小块浸有蒸馏水的纸巾，以维持腔内足够湿度，防止蛹脱水（图 1D）。在 25 °C 下孵育蛹，直至进行解剖。
5. 使用干燥的 6" 竹签轻轻将蛹从微型离心管中推出，置于黑色解剖皿上。在远离蛹的位置放置一段新的双面胶带。
6. 使用一对镊子，小心地将蛹背面向上（即卵壳朝上，图 1B）放置于胶带上（图 2A）。确保蛹牢固地粘附在胶带上。
   注意：蛹壳表面的水分会阻碍其与胶带的牢固粘附；若出现此情况，请先让蛹在空气中干燥后再置于双面胶带上。

2. 眼脑复合体的解剖

1. 使用镊子去除每只蛹的卵盖（图 2C）。
2. 使用显微解剖剪切开或剪开每只蛹的蛹壳。将蛹壳掀开，露出头部、胸部和腹部前段，并将蛹壳边缘固定在双面胶带上（图 2C）。
   注意：无需完全暴露蛹体。
3. 用尖头镊子刺穿每只蛹的腹部以夹住个体，并将其从蛹壳中取出（图 2C）。
4. 将蛹放置于黑色解剖皿中，远离胶带，并加入约 400 µL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）覆盖。
5. 用镊子夹住每只蛹的腹部，使用显微解剖剪在胸部进行整齐的横切，将蛹体切成两半（图 2D）。
6. 将每具尸体的后半部分残余物从 PBS 中移出，置于解剖皿一侧（请勿丢弃，参见步骤 3.2.1）。
7. 使用两把精细镊子，打开每只蛹的胸部和头部，以暴露眼脑复合体（图 2E）。操作时，夹住胸部上皮的切口边缘，逐步撕开胸部，然后撕开头壳，暴露眼脑复合体及其周围的脂肪组织。
8. 在不直接夹取组织的情况下，使用镊子将眼脑复合体从头壳残余物中移出，或将其从撕开的头壳中舀出。
   注意：眼脑复合体呈哑铃形，颜色为乳白色，比周围乳黄色的脂肪组织更透明（图 2B,E）。
9. 用镊子小心去除与眼脑复合体相连的大部分脂肪组织，避免接触眼部组织。

3. 免疫荧光组织处理

1. 按照描述解剖至少6-10只蛹（步骤2.1-2.9）。
   注意：每次解剖进行三到四次独立重复，通常可获得足够的数据用于验证假设。
2. 清洗与固定
   1. 使用干净的剃刀片切割P20或P100移液器吸头的尖端，使开口半径扩大至约1 mm，并通过反复吸取PBS和脂肪混合液进行润滑。该脂肪可从步骤2.6中移除的残余组织中获取。
   2. 将眼-脑复合体转移至盛有约400 µL PBS的9孔玻璃培养皿中，置于冰上。使用已润滑的吸头及P20或P100空气置换移液器进行转移。
      注意：若使用未润滑的吸头，眼-脑复合体会在移液过程中黏附于吸头内壁，导致组织损伤或丢失。
   3. 通过反复吸取PBS使眼-脑复合体轻柔旋转，以去除与眼组织相连的残留脂肪。在此步骤及后续所有清洗步骤中，切勿直接反复吸取眼-脑复合体，以免损伤脆弱的眼组织。
   4. 将眼-脑复合体以最小体积（<20 µL）的PBS转移至至少250 µL固定液中。通过反复移液混匀溶液，在冰上孵育35分钟。
      注意：可使用步骤3.1.1中制备的同一润滑吸头完成此转移操作。
   5. 使用同一移液吸头将眼-脑复合体转移至含有约400 µL PBS的孔中，通过反复移液混匀溶液，并在冰上孵育5-10分钟以完成清洗。至少重复清洗两次。
      注意：在进入步骤3.3.1之前，眼-脑复合体可在最后一次PBS清洗液中于冰上或4 °C条件下保存数小时。
3. 抗体染色
   1. 为在抗体溶液处理前封闭组织，将眼-脑复合体转移至约400 µL PBT中。使用润滑吸头及P20或P100空气置换移液器进行转移，在冰上孵育10至60分钟。
   2. 将适当的抗体用PBT稀释，配制一抗溶液。由于眼-脑复合体将在10 µL分装的抗体溶液中孵育，因此所配制的总体积应为10 µL的整数倍。
   3. 将10 µL抗体溶液分装至72孔微孔板的洁净孔中。
   4. 使用干净的剃刀片切割P10移液器吸头的尖端，使开口半径扩大至约0.5 mm，并通过反复吸取PBT进行润滑。
   5. 使用P10空气置换移液器及润滑吸头，将不超过5个眼-脑复合体（携带体积< <3 µL的PBS）转移至每个含10 µL抗体溶液的孔中。
   6. 通过反复移液使抗体溶液均匀混合。切勿反复吸取眼-脑复合体，以免损伤组织。
   7. 为减少抗体溶液蒸发，可在微孔板内放置一小块浸有蒸馏水的组织，并密封微孔板（例如使用配套盖子）。于4 °C孵育过夜。
   8. 将眼-脑复合体从微孔板转移至盛有约400 µL PBT的9孔玻璃培养皿中进行清洗。使用P10空气置换移液器及PBT润滑吸头（按步骤3.3.4所述方法制备），通过反复移液混匀溶液，在冰上孵育5-10分钟。
   9. 至少重复清洗两次。使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑吸头在不同清洗液之间转移眼-脑复合体。
   10. 根据需要将合适的荧光标记二抗用PBT稀释，配制二抗溶液。每批6-10只蛹使用100 µL二抗溶液已足够。将二抗溶液分装至9孔玻璃解剖皿中。
   11. 将眼-脑复合体转移至二抗溶液中。使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑吸头进行转移。
   12. 在室温下孵育1-2小时，或在4 °C孵育3-5小时。为防止荧光染料因光照而淬灭，需用铝箔包裹样品。
       注意：二抗孵育的最佳时间可能因所使用的一抗和二抗种类不同而有所差异。
   13. 将眼-脑复合体转移至盛有约400 µL PBT的9孔玻璃培养皿中进行清洗。通过反复移液混匀溶液，在冰上孵育5-10分钟。此清洗步骤至少重复两次。
4. 二次固定
   1. 进行二次固定时，将眼-脑复合体转移至至少200 µL固定液中，在室温下孵育20分钟，或在4 °C孵育35分钟。
      注意：二次固定可增强眼组织的硬度，有利于后续封片操作（步骤3.5）。
   2. 使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑吸头，将眼-脑复合体转移至盛有约400 µL PBT的9孔玻璃培养皿中，在冰上清洗5分钟。
   3. 至少重复清洗一次。
   4. 使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑吸头，将眼-脑复合体转移至盛有约400 µL PBS的9孔玻璃培养皿中，在冰上漂洗1-2分钟。通过反复吸取PBS（而非组织本身）使组织保持悬浮状态，防止眼-脑复合体在PBS漂洗过程中沉降并黏附于玻璃皿表面。
5. 封片
   1. 将眼-脑复合体转移至约200 µL封片剂中。使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑吸头进行转移。让组织在封片剂中平衡1-2小时。
   2. 在洁净的显微镜载玻片上滴加5-8 µL新鲜封片剂。
   3. 使用干净的剃刀片切割P10吸头，使开口半径扩大至约0.5 mm，配合P10空气置换移液器，将眼-脑复合体连同5-8 µL封片剂转移至载玻片上的封片剂液滴中。
   4. 使用两根钨针将眼睛与视叶分离。用较粗的钨针将一个眼-脑复合体固定在载玻片上，再用细钨针将每只眼睛从其相连的视叶上切下（图2F）。
   5. 使用细钨针将每只眼睛调整至显微镜载玻片表面，使每只眼睛的基底面紧贴载玻片。轻轻将洁净的盖玻片覆盖在组织上，并用指甲油封固。
      注意：将眼睛在载玻片上排列得彼此靠近或呈直线，有助于后续显微成像。
   6. 使用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察视网膜。
      注意：若不立即成像，应将载玻片存放于4 °C。

结果

图1：用于解剖的蛹的选择与培养。（A）在健康的Drosophila培养瓶壁侧面可找到游走期三龄（L3）幼虫和蛹。（B）前蛹因其半透明的白色外观而易于识别，此时保护性蛹壳尚未产生色素。图中以蓝色标示蛹的前后轴与背腹轴。使用湿润的竹签可将前蛹从培养瓶壁上轻轻剥离并拾取。（C）将蛹放入已正确标记（基因型、收集日期和收集时间）的1.5 mL微量离心管中，并（D）置于由空移液器吸头盒组装而成的加湿培养 chamber 内培养。通过在盒内放置一片湿润的纸巾以维持湿度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
竹制夹板，6"	Ted Pella Inc	116
黑色解剖皿			用SYLG170或SYLG184（加入细磨的活性炭粉末染成黑色）填充至边缘的玻璃培养皿。<br/>室温下放置24–48小时以完成聚合。
刀片夹持器	Fine Science Tools	10053
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
双面胶带	3M	665
果蝇&amp;富营养培养基			7.5%蔗糖，15%葡萄糖，2.5%琼脂，20%酿酒酵母，5%蛋白胨，0.125% MgSO4·7H2O，0.125% CaCl2·2H2O
果蝇&amp;标准培养基			印第安纳大学布卢明顿果蝇资源中心玉米粉配方。<br/>（<a href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html" target="_blank">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a>）
固定液			含4%甲醛的PBS缓冲液，pH 7.4。
镊子	Fine Science Tools	91150-20	应频繁打磨以保持锋利。
甲醛	Thermo Scientific	28908
玻璃9孔培养皿	Corning	7220-85	亦称9孔培养皿
玻璃盖玻片（22 × 22 mm）	Fisher Scientific	12-542-B
玻璃显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm）	Fisher Scientific	12-550-413
玻璃培养皿	Corning	3160-100BO
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
微量离心管	Axygen	MCT-175-C
显微解剖剪	Fine Science Tools	15000-03
微孔板（72 × 10 &micro;L 孔）	Nunc	438733
封片介质			含0.5% N-丙基没食子酸和80%甘油的PBS缓冲液
N-丙基没食子酸	Sigma-Aldrich	P3130
PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，pH 7.4）	Sigma-Aldrich	P5368	按制造商说明配制
PBT			含0.15% TritonX 和 0.5% 牛血清白蛋白的PBS缓冲液，pH 7.4
针头夹持器	Fine Science Tools	26016-12
一抗：山羊抗GAPDH	Imgenex	IMG-3073	用于Western blot，使用稀释比例为1:3000
一抗：兔抗裂解型Dcp-1	Cell signaling	9578S	用于免疫荧光，使用稀释比例为1:100
一抗：大鼠抗DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	用于免疫荧光，使用稀释比例为1:20
一抗：大鼠抗DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	由Tadashi Uemura惠赠，使用稀释比例为1:100。
手术刀片	Fine Science Tools	10050	折下小段刀片并固定于刀片夹持器中。
二抗：488标记驴抗大鼠IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	用于免疫荧光，使用稀释比例为1:200
二抗：Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	用于免疫荧光，使用稀释比例为1:100
二抗：HRP标记山羊抗大鼠IgG（H+L）	Cell Signaling Technology	7077	用于Western blot，使用稀释比例为1:3000
二抗：HRP标记兔抗山羊IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	用于Western blot，使用稀释比例为1:3000
体视解剖显微镜（M60或M80）	Leica Microsystems		或性能相当的显微镜
聚二甲基硅氧烷（黑色）	Dow Corning	SYLG170
聚二甲基硅氧烷（透明）	Dow Corning	SYLG184	用细磨的炭粉染成黑色
纸巾：Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
细钨针	Fine Science Tools	10130-10	插入针头夹持器中
坚固钨针	Fine Science Tools	10130-20	插入针头夹持器中
酵母糊	（本地超市）		约2汤匙Fleischmann's ActiveDry酵母（或类似产品）溶于约20 mL蒸馏H2O中