Drosophila 晚期蛹间接飞行肌（IFM）解剖：一种高通量组织采集方法

摘要

来源：Kao, S. Y., 等。 解剖 黑腹果蝇 用于组学研究的飞行肌. J. Vis. Exp. (2019).

Drosophila 飞行肌被用作研究肌肉发育和生理学的模型系统。本视频介绍了成虫的飞行肌肉结构，并重点展示了一种适用于从蛹中分离发育期间接飞行肌以进行RNA测序的解剖方案。

方案

本方案节选自 Kao 等，解剖 黑腹果蝇 用于组学研究的飞行肌 视频实验杂志 (2019).

1. 48 h APF 后的 IFM 解剖

1. 准备必要的设备，包括两把#5生物级镊子、精细剪刀、标准玻璃显微镜载玻片、双面胶带、移液器、移液器吸头、干冰，以及（用于RNA实验的）裂解试剂（见材料表）。将1×PBS和微量离心管置于冰上预冷。
2. 使用略微湿润的画笔，将发育阶段明确的蛹转移至固定在显微镜载玻片上的双面胶带条上（图1A）。将蛹排成一行，方向一致（腹面朝下，前端朝向载玻片底部）。
   注意：注意不要在画笔或滤纸上使用过多水分，否则蛹无法牢固粘附。若蛹粘附不牢，可先将其转移至干燥的滤纸或纸巾上使其干燥。每次粘附的蛹数量应控制在30分钟内可完成解剖的数量，理想情况下约为10只蛹。
3. 将蛹从蛹壳中取出。用镊子轻轻分离并打开位于前气门上方的蛹壳（图1B）。
4. 将一对镊子从背部向后端轻轻滑动，同时剪开蛹壳（图1B'）。注意不要刺破下方的蛹体。将蛹从打开的蛹壳中取出，并立即转移至另一张载玻片上的1×PBS液滴中（图1B",C）。
5. 对排列好的所有蛹重复步骤1.3和1.4，然后将带有双面胶的载玻片暂时放置一旁。
6. 使用精细剪刀，将蛹的腹部从胸部切下，并推至一旁形成单独的一堆（图1D,D'）。对剩余的蛹重复此操作。
   注意：从步骤1.6开始计时解剖持续时间，因为一旦蛹体完整性被破坏即应开始计时。应在20–30分钟内尽可能多地完成解剖，以防止细胞死亡及其引发的转录组和蛋白质组变化。在解剖1日龄成虫或>90小时的蛹时，为便于后续操作，通常可额外使用精细剪刀去除头部。
7. 用纸巾吸除大部分1×PBS（通常因悬浮脂肪而呈浑浊状）以及腹部组织堆（图1E）。向剩余的胸部组织中加入一滴新鲜且预冷的1×PBS。
8. 使用剪刀沿身体纵轴从头部向下一次性将胸部纵向切为两半（图1F,F'）。或者，若头部已被移除，可先将剪刀插入原头部连接处，沿IFM之间纵向切开胸部上半部分，然后在同一方向进行第二次切割，切开胸部腹侧。
9. 对所有待解剖的蛹重复步骤1.7和1.8，在载玻片中央附近形成一堆胸部半切组织。确保载玻片上有足够的预冷1×PBS，以防止半切组织干燥。
   注意：在蛹发育48小时后（APF），间接飞行肌（IFMs）已足够大，经训练的操作者可在标准解剖显微镜下清晰观察。在此步骤中，若肌肉带有荧光标记，可将其转移至荧光解剖显微镜下以辅助识别IFM或用于培训目的，但此操作并非必需。
10. 从胸部组织中解剖出IFM。使用#5镊子固定其中一个半切胸部组织（图1G,H）。将一把镊子的尖端轻轻插入IFM中段的上方和下方（图1G',H'）。保持第一把镊子不动，使用精细剪刀将IFM一端从体壁和肌腱上剪下，然后将另一端也从体壁上剪离（图1G'',H''）。
    注意：根据首次切割后胸部的朝向，可将胸部旋转180°，以便更方便地进行第二次IFM切割。
11. 用镊子将IFM束从胸部组织中取出（图1G''',H'''），转移至PBS液滴边缘，利用表面张力将其固定（图1I）。将残余组织推至载玻片另一侧。对剩余的胸部半切组织重复此操作，收集所有解剖出的IFM。
    注意：若IFM无法整齐堆叠，可用纸巾吸除部分1×PBS。注意不要让所有PBS蒸发，确保解剖出的IFM和半胸部组织始终被缓冲液覆盖。
12. 完成所有IFM解剖后，迅速进行质量控制。使用#5镊子去除可能混入样本中的跳跃肌或体壁碎片（图1J-K''）。
    注意：跳跃肌在形态上与IFM不同。若在荧光下解剖Mef2-Gal4标记的肌肉，跳跃肌荧光较弱，且形状和质地不同；在普通光线下，其近乎透明，而IFM则呈不透明的乳黄色（图1J-J'',K）。
13. 利用液体表面张力，用一对镊子夹住解剖出的IFM（但不要压碎）（图1L）。将IFM转移至预先装有250 μL预冷1×PBS的1.5 mL微量离心管中（图1M）。立即进入第2部分操作。
    注意：当镊子尖端靠近并从缓冲液中提起时，表面张力会在镊尖之间形成一个缓冲液泡。若IFM位于该液泡中，则可随液泡被提起并轻松转移至另一个盛有缓冲液的容器中。操作时应轻压镊子使尖端接近但不接触，以避免压碎液泡中的组织。

2. 沉淀并保存IFM样本

1. 将1.5 mL微量离心管在台式离心机中以2,000 × g离心3–5分钟，沉淀IFMs（图2A,B）。
2. 使用移液器吸头吸除上清液（图2C）。
3. 若用于RNA实验，将IFM沉淀重悬于50–100 μL所需的RNA提取缓冲液中（见材料表，图2D）。否则，继续进行步骤2.4。
   注意：IFMs可在步骤2.2后直接冷冻干燥，用于质谱分析或使用商业试剂盒提取RNA（见代表性结果）。对于RNA实验，立即将IFM沉淀重悬于提取缓冲液中并速冻，可获得更佳效果。
4. 将样品置于干冰上冷冻，或在液氮中快速冷冻（图2E）。随后于-80 °C保存，直至进行后续样品制备步骤。
   注意：冷冻保存后，样品可在数月内保持稳定，适合后续分析前的储存。

结果

图1：羽化后48小时IFM的解剖。（A）将蛹体用双面胶带固定并排列整齐。（B）通过从前端打开并沿背侧剪开蛹壳（B'），将蛹体取出（B''）。圆圈符号的含义与图2中相同。（C）将蛹体转移至缓冲液中。（D）用剪刀剪除腹部（黄色双箭头）（D'），并与胸部分离。（E,F）加入洁净缓冲液（E），然后沿纵轴将胸部切为两半（F,F'

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm 培养皿	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	60 mm × 15 mM 透气格雷纳培养皿
手机摄像头，三星 Galaxy S9	三星	SM-G960F/DS	用于未在显微镜下拍摄的照片
双面胶带	Scotch/3M	3M ID 70005108587	双面胶带，大多数办公用品供应商均有售
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	Inox直头镊，11厘米，生物级，尖端尺寸0.05毫米 × 0.02毫米
荧光解剖显微镜相机，Leica DFC310 FX 相机	Leica		www.leica-microsystems.com
荧光解剖显微镜软件，Leica Application Suite (LAS) 版本 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
荧光解剖显微镜，Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
果蝇：Bru1[M2]			果蝇品系；本文
果蝇：Bru1[M3]			果蝇品系；本文
果蝇：Mef2-GAL4	布卢明顿果蝇资源中心	BDSC:27390	果蝇品系
果蝇：salm[1]	布卢明顿果蝇中心	3274	果蝇品系
果蝇：salm[FRT]			果蝇品系；参见 Spletter 等，Elife，2018
果蝇：UAS-Bru1IR	维也纳果蝇研究中心	GD41568	果蝇品系，RNAi发夹
果蝇：UAS-GFP::Gma	布卢明顿果蝇资源中心	BDSC:31776	果蝇品系
果蝇：UAS-mCD8a::GFP	布卢明顿果蝇资源中心	BDSC:5130	果蝇品系
果蝇：w[1118]	布卢明顿果蝇资源中心	3605	果蝇品系
果蝇：weeP26			果蝇品系；参见 Clyne 等，Genetics，2003
GFP 检测试剂，GFP-Booster	ChromoTek	gba488-100
糖原	Invitrogen	10814-010
图像处理软件，Photoshop CS6	Adobe		www.adobe.com
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-丙醇
方法1（RNA提取）：TRIzol	Life Technologies	15596018	异硫氰酸胍和苯酚单相溶液
方法2（RNA提取）：方法1 + TURBO DNA-free试剂盒	Invitrogen	AM1907	TRIzol 提取后，使用试剂盒去除 DNA
方法3（RNA提取）：Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒	Zymo Research	R2070S	使用TRIzol进行RNA提取，但采用商用柱式纯化方法而非相分离法。 <br/>建议使用Monarch DNase I及其配套的Monarch DNase I反应缓冲液进行DNase处理。
方法4（RNA提取）：RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	我们采用了提供的DNase处理方案。按照动物组织的建议方法，将IFM沉淀在RTL缓冲液中进行匀浆。
方法5（RNA提取）：ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Z6110	我们采用了“从纤维组织中纯化RNA”的实验方案。
方法6（RNA提取）：Monarch Total RNA Miniprep Kit	New England Biolabs	T2010G	我们采用该方案处理组织/白细胞，并在300中裂解 &micro;L RNA保护试剂
微量离心管	Thermo Fisher	AM12400	无RNase的微量离心管，1.5 mL
显微镜载玻片	Thermo Fisher	12342108	标准载玻片，未带电，1 mm
画笔	马拉布	1910000000	Marabu Fino 圆头画笔 0 号，或任何美术用品品牌的类似画笔
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
PBS缓冲液（1x）	Sigma-Aldrich	P4417	磷酸盐缓冲液片剂（用于配制 1 L 溶液，pH 7.4）
PFA PureTip 吸头	Elemental Scientific	ES-7000-0101	可选的标准移液器吸头替代品，以减少样品损失；100 mL，0.8 mm 孔径
移液器吸头	Sigma-Aldrich	P5161	通用型 200 mL 吸头
RNA浓度 方法1 &amp; RNA 完整性检测，Bioanalyzer	安捷伦科技	G2939BA
RNA浓度方法2，Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
RNA浓度检测方法3：Qubit 4荧光计	Invitrogen	Q33238
RNase A	Promega	A7937
无RNase水，焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma-Aldrich	D5758	用DEPC处理水过夜，然后高压灭菌，以去除所有RNase。
RT试剂盒#1：Super Script III反转录酶试剂盒	Invitrogen	18080-044	逆转录试剂盒
RT试剂盒#2：LunaScript	New England Biolabs	E3010S	逆转录试剂盒
RT试剂盒#3：QuantiNova反转录试剂盒	Qiagen	205410	逆转录试剂盒
统计软件：GraphPad Prism	GraphPad Prism		www.graphpad.com
统计软件：Microscoft Excel	Microsoft		作为 Office Home 套餐的一部分购买 &amp; 学生 2019
台式离心机	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 或同等型号
组织/吸水纸	Sigma-Aldrich	Z188956	标准组织擦拭纸
移液管	Sigma-Aldrich	Z350796	塑料移液管
Vannas弹簧剪	精细科学工具	15000-00	3 mm切割刃，尖端直径0.05 mm，长度8 cm
沃特曼滤纸	Sigma-Aldrich	1004-070	滤纸圆片，4号，70 mm