体内果蝇钙成像:一种神经元活动功能成像的方法

此协议摘自 Hancock 等人，黑腹果蝇学习诱导突触可塑性的体内光学钙成像，J. Vis. Exp.（2019 年）。

1. 体内钙成像

1. 使用配备有红外激光器和水浸物镜（参见材料表）的多光子显微镜，安装在隔振台上。为了可视化基于 GFP 的钙指示剂，将激光器调谐到 920 nm 的激发波长并安装 GFP 带通滤光片。
2. 使用粗略的 Z 调节旋钮，扫描大脑的 Z 轴并找到感兴趣的大脑区域。使用裁剪功能将扫描仅集中在此区域，以最大限度地缩短扫描时间，并旋转扫描视图，使头部前部朝下。
3. 将帧大小调整为 512 x 512 像素，将扫描速度调整为 > 4 Hz，并将扫描区域（在 Y 维度中）调整为 512 x 512 像素，以便覆盖感兴趣的神经元。

2. 通过嗅觉调节实现气味诱发钙瞬变的可视化

1. 使用可以以时间精确的方式传递多种气味刺激的气味输送系统。
   1. 使用另一台计算机来控制设备，并与成像显微镜软件通信，以协调实验期间的气味刺激与图像捕获。
   2. 启动一个预编程的宏软件包，该软件包能够将图像采集软件和气味输送程序（例如，安装在显微镜控制软件中的 VBA 宏软件包，参见材料表）连接起来，该程序响应由在单独的程序中启动气味输送方案提供的外部输入触发器）。
2. 通过以 512 x 512 px 的分辨率和 4 Hz 的帧速率监测"预训练"/朴素气味诱发钙瞬变来开始测量。在气味开始前 6.25 秒（建立 F₀ 基线值）和气味偏移后 12.5 秒内提供 2.5 秒的气味刺激，两侧是额外的图像采集。用第二种加臭剂重复此作，然后用第三种加臭剂。
3. 测量后 3 分钟继续进行经典调节（"训练"）果蝇。
   1. 选择一种在"预训练"阶段出现的气味成为 CS⁺ 气味，选择另一种成为 CS^- 气味。使用计算机控制的气味输送系统呈现 CS⁺ 气味 60 秒，同时进行 12 次 90 V 电击。
   2. 休息 60 秒后，单独呈现 CS^- 气味 60 秒。用作加臭剂 4-甲基环己醇和 3-辛醇。在此训练期间不要使用第三种气味剂（例如，1-辛烯-3-醇），因为它仅在训练阶段之前（步骤 2.2）和之后（步骤 2.4）用作对照。
4. 在完成训练阶段（步骤 2.3）后 3 分钟，通过重复"训练前"气味刺激方案（步骤 2.2）再次测量"训练后"气味诱发的钙瞬变><。 注意:此步骤的时间应反映记忆形成后感兴趣的时间（例如，在条件反射步骤后 3-4 分钟执行此步骤以研究短期记忆）。通常，苍蝇可以在这种准备中存活数小时。
5. 以适当的格式（例如 Tiff）保存成像文件，以供以后的图像分析。