Drosophila 体内 钙成像：神经元活动功能成像的一种方法

摘要

来源：Hancock, C. E. 等 在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性 黑腹果蝇. J. Vis. Exp. (2019).

本视频介绍 体内 钙成像在 果蝇 使用GCaMP记录神经元活动。本视频展示在嗅觉条件反射实验期间，如何记录蘑菇体神经元中GCaMP荧光的变化。

方案

本方案节选自 Hancock 等 体内 学习诱导的突触可塑性的光学钙成像 黑腹果蝇， 视频实验杂志 (2019).

1. 体内钙成像

1. 使用配备有红外激光器和水浸物镜的多光子显微镜（参见材料表），并将其安装在防震台上。为观察基于GFP的钙指示剂，将激光器调至920 nm的激发波长，并安装GFP带通滤光片。
2. 使用粗调Z轴旋钮，沿脑组织的Z轴方向进行扫描，定位目标脑区。利用裁剪功能将扫描范围聚焦于该区域，以缩短扫描时间，并旋转扫描视野，使头部前方向下。
3. 将帧尺寸调整为512 × 512像素，扫描速度设为> 4 Hz，并调整扫描区域（Y方向），确保覆盖目标神经元。

2. 通过嗅觉条件化观察气味诱发的钙瞬变

1. 使用一种能够以精确时间方式递送多种气味刺激的气味递送系统。
   1. 使用一台额外的计算机来控制该设备，并与成像显微镜软件通信，以在实验过程中协调气味刺激与图像采集。
   2. 启动一个预编程的宏程序包，该程序包能够连接图像采集软件与气味递送程序（例如，安装在显微镜控制软件中的 VBA 宏程序包，参见 材料表），并能响应由独立程序中启动气味递送协议所提供的外部输入触发信号。
2. 以 512 × 512 像素的分辨率和 4 Hz 的帧率，开始监测"训练前"/未经训练的气味诱发钙瞬变。递送持续 2.5 秒的气味刺激，并在气味开始前额外采集 6.25 秒图像（以建立 F₀ 基线值），在气味结束后再额外采集 12.5 秒图像。依次对第二种和第三种气味分子重复此过程。
3. 在此测量结束后继续进行 3 分钟的经典条件化训练（"训练"），以训练果蝇。
   1. 从"训练前"阶段呈现的气味中选择一种作为 CS⁺ 气味，另一种作为 CS^- 气味。通过计算机控制的气味递送系统呈现 CS⁺ 气味，持续 60 秒，同时施加十二次 90 V 的电击。
   2. 在 60 秒休息后，单独呈现 CS^- 气味 60 秒。使用的气味分子为 4-甲基环己醇和 3-辛醇。在本训练阶段中不呈现第三种气味分子（例如 1-辛烯-3-醇），因其仅在训练前（步骤 2.2）和训练后（步骤 2.4）作为对照使用。
4. 在完成训练阶段（步骤 2.3）3 分钟后，再次重复"训练前"的气味刺激方案（步骤 2.2），以重新测量"训练后"的气味诱发钙瞬变。
   注意：此步骤的时间点应反映记忆形成后所关注的时间（例如，在条件化步骤后 3–4 分钟执行此步骤，以研究短期记忆）。通常，果蝇在此制备条件下可存活数小时。
5. 将成像文件以适当格式（例如 Tiff）保存，用于后续图像分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-辛烯-3-醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	用作气味剂的化学物质
3-辛醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	用作气味剂的化学物质
4-甲基环己醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	用作气味剂的化学物质
EGFP带通滤光片（525/50 nm）	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
矿物油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	用作气味剂的稀释剂
锁模钛宝石激光器Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		可调谐红外飞秒激光器
配备BiG检测器的多光子显微镜LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		多光子显微镜，多家公司提供类似设备。
Plan-Apochromat 20x（NA = 1.0）水浸物镜	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	物镜W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) 软件，用于接收来自气味递送装置和电刺激装置（电源）的触发信号，并与控制显微镜的Zeiss ZEN软件进行交互	定制编写，可根据要求提供	n.a.	n.a.