C. elegans 性腺外翻：一种快速解剖技术

摘要

来源：Gervaise, A. L. 和 Arur, S. 活性ERK在时空上的分析 秀丽隐杆线虫 生殖系. 视频实验杂志 (2016).

本视频介绍了一种从成年C. elegans雌雄同体线虫中分离性腺的实验方法，所获得的组织适用于免疫染色和荧光成像。

方案

本实验方案节选自 Gervaise 和 Arur 的视频文章《秀丽隐杆线虫生殖系中活化 ERK 的时空分析》（Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline），《视觉化实验杂志》（J. Vis. Exp.）(2016年)。

1. 获取性腺的成虫解剖

1. 挑选100–150条野生型（N2）或所需基因型的线虫，处于所需且特定的发育阶段（L1、L2、L3、L4、成虫） 等等在1.5 mL微量离心管中，加入100 µL M9缓冲液。
2. 向微量离心管中加入 900 µL M9 缓冲液（参见 材料表). 在常温下，将离心管于微量离心机中以1,000 × g离心1分钟。
3. 轻轻移除 900 µL 的 M9 缓冲液并弃去。在解剖显微镜下移除缓冲液，以确保不会意外移走线虫。
4. 重复步骤1.2至1.3两次，每次使用新鲜的M9缓冲液。此操作可有效去除随线虫带入的任何细菌。
5. 最后一次洗涤后，从离心管中移除900 µL M9缓冲液并弃去。
6. 将剩余的100 µL M9缓冲液（含有100–150条线虫）用200 µL移液器吸头转移至平底玻璃培养皿中。使用前确保移液器吸头已在10 µL刻度处剪断。若不剪断吸头，会导致线虫被剪切损伤。
7. 向含有线虫的M9缓冲液的玻璃培养皿中加入1 - 3 µL的0.1 M左旋咪唑。轻轻摇动，使左旋咪唑与M9缓冲液充分混匀，直至线虫停止运动。
   注意： 左旋咪唑储备液可于 -20 °C 长期保存。此处使用的左旋咪唑浓度为 1 - 3 mM，高于文献中报道的 0.2 - 0.25 mM，目的是使动物迅速丧失运动能力。若动物在液体悬浮液中挣扎时间过长，可能导致性腺中 dpERK 的表达模式出现变异（可能由应激或营养缺乏或二者共同引起）。使用 1 - 3 mM 左旋咪唑进行解剖可获得更稳定的染色模式。
8. 将两支25 G针头连接至两个1 mL注射器上（注射器的大小无关紧要，针头的规格至关重要）。每只手各持一支注射器，图1).
9. 在解剖显微镜下，将每根针按图示置于每条线虫的下方和上方 图1 用剪刀样动作在蠕虫的第二咽部球附近进行精细切割。对一条蠕虫完成一次切割后，继续对下一条动物操作，直至培养皿中的所有动物至少被切割一次。
   注意： 请注意，步骤 1.8 - 1.9 对时间敏感。应在五分钟内完成培养皿中所有线虫的解剖，以获得可重复的 dpERK 表达模式。解剖时间过长将导致 dpERK 信号减弱，尤其是在第 1 区。根据每轮解剖的线虫数量进行调整（即，50 条蠕虫 与 如有必要，可调整至150）以保持在规定的时间范围内。
   1. 如果在解剖过程中未观察到外翻的性腺，则不要在同一动物个体上尝试再次切割。通常这只会导致线虫被剪断，而无法使性腺外翻。应直接进行下一个个体的操作。在第6步制备的载玻片中，性腺未外翻的线虫将清晰可见，成像时可忽略这些样本。
      注意： 在整个解剖和处理过程中，需始终注意性腺将保持与身体/尸体相连。切勿使用针头强行将性腺与身体分离，试图将性腺从身体上撕离时，常会导致性腺组织出现异常撕裂，进而引发非特异性抗体信号。在成像步骤中可忽略身体/尸体部分，仅对性腺进行成像。此外，有时肠道细胞也可作为所检测抗体的内参对照/体细胞对照。

图1：解剖过程中针头位置示意图。左侧：正在进行解剖操作的实物照片。右侧：针头相对于线虫的位置示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平底玻璃培养皿	Agar Scientific	AGL4161	我们使用玻璃器皿，因为解剖后的性腺常会黏附在塑料表面
25 G 针头	BD PrecisionGlide	305122
注射器（可选用 1 或 5 mL）	BD Syringes	1 mL: BD 309659
显微镜载玻片（25 × 75 × 1.0 mm）	Fisherbrand	12-550-343
临床台式离心机
*M9 溶液
左旋咪唑	Sigma	L9756
*M9 缓冲液配方			3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 mL 1 M MgSO4，加 H2O 至 1 L。