单条线虫PCR：基因组DNA提取与扩增方法

摘要

来源：Prior, H., 等. 利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白快速简便地在C. elegans中生成基因组点突变体的流程. J. Vis. Exp. (2018).

本视频介绍了一种通过PCR筛选快速检测单个线虫遗传标记的技术。在示例实验方案中，我们采用该方法筛选基于CRISPR的基因组编辑。

方案

以下方案节选自 Prior et al 的文章《利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白快速简便地构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组点突变体的流程》，发表于《J. Vis. Exp.》（2018年）。

单条线虫 PCR 与基因分型

1. 在产卵后1 - 2天，使用线虫挑取工具将F₁代个体转移至含有7 µL线虫裂解缓冲液的PCR条状管盖中（表1，图1D，第4 - 5天）。
2. 将PCR管在室温下以最大转速离心1分钟，使线虫沉降至管底，随后将管子置于-80 °C冷冻1小时。
   注意：线虫可在-80 °C长期保存。
3. 使用热循环仪对冷冻的线虫进行裂解，程序如下：60 °C孵育60分钟，95 °C孵育15分钟，4 °C保存。
4. 按表2所示配制PCR主混合液。
5. 向洁净的PCR管中加入21 µL PCR主混合液，再加入4 µL第3步所得的线虫裂解液。使用移液器充分混匀，并按照试剂制造商的指南运行PCR程序（参见材料表）。
6. 使用DNA纯化与浓缩试剂盒对PCR产物进行纯化，操作步骤遵循制造商说明书（参见材料表）。通过向离心柱中加入10 µL水洗脱DNA。
7. 按表3所示配制限制性内切酶主混合液。
8. 将10 µL限制性内切酶主混合液加入每个已纯化的PCR反应产物中，37 °C孵育1 - 2小时。
9. 使用1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，在120 V电压下对酶切后的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。

结果

图1. CRISPR-Cas9对的基因编辑 C. elegans sod-1 位点 (A) 外显子-内含子结构示意图 sod-1 位点在 秀丽隐杆线虫红色条形表示外显子3中G93的位置。引物对（F1-R1）由红色箭头标出。B人与小鼠的序列比对 秀丽隐杆线虫 （线虫）SOD-1 蛋白。目标 G93 位点以红色标出。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无核酸酶水	Synthego 公司	随 sgRNA 试剂盒 EZ 试剂盒提供
KCl	Sigma	P5405
DNA 纯化 & 浓缩器	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start 高保真 2X 预混液	新英格兰生物实验室	M0494L
蛋白酶K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap 去污溶液	Fisher Scientific	AM9780