尼罗红染色 秀丽隐杆线虫一种在固定动物中可视化脂滴的方法

摘要

来源：Escorcia, W., 等. 脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色. 视频实验杂志 (2018).

本视频介绍了一种使用尼罗红染料对完整且已固定的线虫进行脂质染色的实验方案。  为特异性观察脂滴核心中的中性脂质，应对染色后的 C. elegans 进行绿色发射光谱成像。

方案

本实验方案摘自 Escorcia et al，通过尼罗红与油红O染色对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中脂质丰度的定量及脂质分布的评估，《视觉化实验杂志》（J. Vis. Exp.）(2018年)。

1. 脂质的尼罗红（NR）染色

1. 5 mg/mL NR 储备液的制备
   1. 在 500 mL 瓶中，将 100 mg NR 粉末加入 200 mL 100% 丙酮中。
   2. 用铝箔包裹瓶子，避免任何光照。
   3. 使用前，在避光条件下搅拌溶液 2 小时。
   4. 长期使用时，将 NR 储备液储存于密封严密的瓶中，并避免任何光照。根据研究需要调整 NR 储备液的配制量。为获得一致的染色和成像结果，确保在所有 NR 染色实验中使用同一批次的储备液。
2. NR 工作液的制备
   1. 每 1 mL 40% 异丙醇（v/v），加入 6 µL NR 储备液。
   2. 每个样品准备 600 µL NR 工作液。
      注意：染色前现配 NR 工作液。根据所需 NR 储备液的体积，使用 15 mL 或 50 mL 带刻度的锥形管。
3. 线虫 NR 脂质染色前处理
   1. 在接种了对数后期 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）上，于 20 °C 培养线虫至早期 L4 阶段。
   2. 用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液 + 0.01% Triton X-100（PBST）溶液将线虫从培养板上洗下，并将线虫悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 以 560 × g 离心 1 分钟，弃上清液，重复此步骤直至悬液中 E. coli 被清除。
   4. 向线虫沉淀中加入 100 µL 40% 异丙醇，在室温下孵育 3 分钟。
   5. 以 560 × g 离心 1 分钟，弃上清液，注意不要扰动线虫沉淀。
      注意：若使用较大培养板或每板染色更多线虫，应增加 PBST 用量以充分洗脱线虫。线虫固定前，PBST 洗涤时间不应超过 15 分钟。若上清液中仍有细菌残留，需增加洗涤次数。在 40% 异丙醇中的孵育步骤应使用旋转混合仪（nutator）或摇床进行。始终监控离心管，确保样品充分混匀。
4. NR 脂质染色
   1. 在避光条件下，向每个样品中加入 600 µL NR 工作液，轻轻颠倒离心管三次，使线虫在 NR 溶液中充分混匀。
   2. 在室温避光条件下旋转孵育 2 小时。
   3. 孵育结束后，以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。
   4. 加入 600 µL PBST，在避光条件下孵育 30 分钟，以去除多余的 NR 染料。
   5. 以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，仅保留约 50 µL 上清液。
      注意：NR 孵育步骤无需振荡。此步骤中线虫自然沉降是正常现象。
5. 显微镜成像载玻片的制备
   1. 将线虫沉淀用残留的上清液重悬。
   2. 取 5 µL 线虫悬液滴加于显微镜载玻片上，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
   3. 成像前用指甲油密封盖玻片边缘。
   4. 每次仅制备少量载玻片，以确保各样品间 NR 成像条件一致。NR 染色样品的图像质量在 6 小时后逐渐下降，脂滴结构变得难以分辨，背景荧光增强，干扰 NR 信号的检测。
6. NR 染色线虫的成像
   1. 以 5× 放大倍数成像，使每个视野中包含多个个体。
   2. 切换至 10× 放大倍数，以便对单个线虫进行更精确的定量分析。
   3. 使用 FITC/GFP 通道对 NR 染色线虫进行成像，并尝试不同曝光时间，以确定最佳定量条件。
   4. 将文件保存为 TIF 格式，以避免因压缩导致数据丢失。
      注意：典型曝光时间范围为 100–1000 ms。确定最佳曝光时间后，所有样品均应使用相同参数，以保持成像一致性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Imager.M2m 显微镜	Zeiss	n/a	荧光显微镜
ERC5s 相机	Axiocam	n/a	彩色成像功能
MRm 相机	Axiocam	n/a	荧光成像功能
Nile red	Thermo Fisher	N1142	脂质染料
异丙醇	BDH	BDH1133-1LP	固定液
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	离心机
Tube Rotator	VWR	10136-084	试管旋转仪