乙醇固定与DAPI染色：一种用于可视化 C. elegans 中DNA的方法

摘要

来源：Clarke, E. K. 等人。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中倍性的调控。J. Vis. Exp. （2018）。

本文介绍了一种用于在固定且完整的线虫中可视化基因组DNA的技术。视频中包含一个示例实验方案，用于计数未受精的C. elegans卵母细胞中的染色质。

方案

本方案节选自 Clarke et al 的文章《秀丽隐杆线虫倍性操作》，操纵 Caenorhabditis elegans， J. Vis. Exp. (2018)。

可以通过计数未受精卵细胞中的染色体数目来验证四倍体品系。如果品系带有染色体荧光标记，可利用荧光显微镜检测未受精二倍体卵细胞（减数分裂前）中染色体对的数量。在缺乏染色体荧光标记的情况下，可通过固定线虫并使用DNA染料染色来筛选四倍体线虫；以下提供了乙醇固定及整体动物4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色的实验方案。

整体动物DAPI染色

注意：可通过对携带12对连接染色体的四倍体品系进行DAPI染色，并计数其未受精卵细胞中DAPI信号体的数量，来验证该品系。

1. 加入5至10 µL M9缓冲液 在显微镜载玻片上放置一滴液体，然后将6至10条线虫转移至液滴中。
2. 在解剖显微镜下，用无绒擦拭纸吸去液滴中的大部分M9溶液，注意不要移走线虫。随后立即向线虫中加入10 µL 90%乙醇液滴。让线虫完全干燥，但干燥时间不超过数秒。
3. 一旦乙醇蒸发（可在解剖显微镜下观察到该过程），立即向线虫中加入额外的10 µL 90%乙醇。
4. 重复步骤 3.1.3 三次。
5. 待乙醇最后一滴完全挥发后，加入6 µL DAPI或Hoechst染料，使其在所选封片剂中达到推荐的终浓度（例如，将2 ng/µL的DAPI储备液以1:1,000比例稀释于M9中）。若需长期保存载玻片，可使用含0.5%对苯二胺（p-phenylenediamine）的抗荧光淬灭溶液替代仅使用M9，该溶液由20 mM Tris-HCl（pH 8.8）溶解于90%甘油中配制而成。
6. 用盖玻片覆盖载玻片上的线虫，并用指甲油密封盖玻片边缘。加盖盖玻片后至少等待10分钟，再在荧光显微镜下观察（步骤3.1.7）。未加抗荧光淬灭剂的载玻片可在4 °C保存数天后再观察，但荧光信号质量会在数天后开始下降。
7. 使用荧光显微镜在100倍放大倍数下，对最成熟的未受精卵母细胞中单个DAPI染色体团（推测为单对染色体）的数量进行计数，该卵母细胞紧邻储精囊，尚未进入储精囊或子宫。
   1. 为对卵母细胞核内的单个DAPI信号体进行计数，应使用显微镜的细调焦旋钮，在计数时从卵母细胞核的顶部缓慢聚焦至底部。随后，在反向移动焦平面的过程中重新计数同一细胞核。即，从细胞核底部到顶部）以确认计数的DAPI信号体数量。
8. 在每种稳定的 Lon 品系中，至少选取十只雌雄同体个体，分别对其两个性腺中最为成熟的未受精卵母细胞进行评分。野生型卵母细胞平均含有 6 个 DAPI 染色体团，对应 5 对常染色体和 1 对性染色体。若在稳定 Lon 品系的卵母细胞中观察到 12 个 DAPI 染色体团，则表明该品系个体为部分（4 套常染色体，3 条 X 染色体）或完全（4 套常染色体，4 条 X 染色体）四倍体。
9. 计算每种品系多个（至少10个）卵母细胞中观察到的DAPI信号体的平均数量。某些染色体对会相互接触或重叠，因此卵母细胞中的DAPI信号体数量通常少于实际的染色体对数目。
10. （可选）为进一步验证平均DAPI小体数量为12的稳定Lon品系，可通过针对染色体轴蛋白（如HTP-3）的免疫荧光染色，检测其为完全四倍体（4A, 4X）或部分四倍体（4A, 3X）。该染色可区分染色体配对情况：在部分四倍体中，未连接的单条染色体会呈现十字形（cruciform）模式，而完全四倍体则显示正常的配对结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖显微镜	Motic Microscopy	SMZ171
名称	公司	目录编号	备注
染色
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
名称	公司	目录编号	备注
乙醇固定
乙醇，纯品，190 Proof（95%），USP	Koptec, VWR	89125-166
名称	公司	目录编号	备注
M9缓冲液
氯化钠，生物技术级	VWR	97061-278
磷酸二氢钾，无水级	VWR	97062-346
磷酸二氢钠二水合物	Fisher Scientific	AC271750025