RNAi 铺板用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）饲喂：一种在大肠杆菌（E. coli）中诱导靶向 dsRNA 表达的技术

摘要

来源：Kolundzic, E., 等. 应用RNA干扰与热激诱导转录因子表达将秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖细胞重编程为神经元. 视觉化实验杂志（J. Vis. Exp.） (2018).

本视频介绍了在C. elegans中进行RNAi治疗的原理，并演示了在转基因线虫品系中敲低lin-35的实验方案。

方案

本方案节选自 Kolundzic， 等 应用RNA干扰与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元 秀丽隐杆线虫, 视觉实验杂志. (2018).

1. 溶液配制
   1. NGM-琼脂平板（1 L）
      1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨培养基（例如 Bacto-Peptone）和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄₄，1 mL 1 M CaCl₂，25 mL 1 M K₂PO₄₄，以及1 mL两性霉素B（2.5 mg/mL 储液）。
   2. NGM-琼脂RNAi平板（1 L）
      1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨培养基和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄₄，1 mL 1 M CaCl₂，25 mL 1 M K₂PO₄，1 mL 两性霉素B（2.5 mg/mL 储液），1 mL 1 M IPTG，以及1 mL 羧苄青霉素（50 mg/mL）。
   3. LB 琼脂（1 L）
      1. 加入10 g蛋白胨培养基、5 g酵母提取物、5 g NaCl、20 g琼脂、10 mL 1 M Tris（pH 8.0）。加H₂0至1升。高压灭菌后，加入1毫升50毫克/毫升羧苄青霉素和2.5毫升5毫克/毫升四环素。
   4. LB培养基（1 L）
      1. 加入10 g蛋白胨培养基、5 g酵母提取物、5 g NaCl和10 mL 1 M Tris（pH 8.0）。加入H₂0至1 L。高压灭菌后，加入1 mL浓度为50 mg/mL的羧苄青霉素。
   5. M9缓冲液（1 L）
      1. 加入 6.0 g Na₂HPO₄，3 g KH₂PO₄，5 g NaCl 和 50 mg 明胶。使用前加入 1 mL 1 M MgSO₄₄.
   6. 漂白溶液（10 mL）
      1. 加入1 mL NaClO和2 mL 5 N NaOH，加水至10 mL。
2. RNAi 平板的制备
   注意： 秀丽隐杆线虫（C. elegans）通常在实验室中培养于含有7.5 mL线虫生长培养基琼脂（NGM-琼脂）的6 cm培养皿中。本方案适用于在15 °C条件下培养的线虫。制备NGM培养皿时，应采用标准无菌操作技术，以防止真菌和细菌污染。以下是制备添加RNAi试剂的NGM培养皿的实验方案。
   1. 制备含有1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和50 µg/mL羧苄青霉素的6 cm NGM-琼脂RNAi平板。在室温避光条件下干燥24–48小时。¹².
      1. 将RNAi平板置于4°C避光保存。若超过14天请勿使用。
   2. 选择RNAi细菌（大肠杆菌 HT115) 含有L4440质粒的克隆 lin-53 从含有50 µg/mL羧苄青霉素和12.5 µg/mL四环素的LB-琼脂平板上，利用三区划线法从现有RNAi文库的冻存甘油菌种中分离单个菌落，获取目的基因DNA序列。将细菌在37 °C下过夜培养。该克隆可实现IPTG依赖性的蛋白表达 lin-53 细菌中的dsRNA。
      1. 此外，培养含有L4440质粒但无任何基因序列的RNAi细菌，作为空载体对照。
   3. 第二天，挑取一个单菌落 lin-53 或使用200 µL枪头将空载体LB琼脂平板上的菌落分别接种至含有2 mL添加50 µg/mL羧苄青霉素的液体LB培养基的独立培养管中。在37 °C下过夜培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD）达到0.6–0.8。使用分光光度计测定OD值。
      注意：液体 LB 培养基不应含有四环素，而用于从甘油菌种划线接种细菌的 LB 琼脂平板则应含有四环素，因为在喂养过程中添加四环素会导致 RNAi 效率降低。
   4. 加入每种细菌培养物各 500 µL（lin-53 将质粒（或空载体）使用多通道移液器加入6 cm NGM-琼脂RNAi平板中。将平板盖上盖子，在室温避光条件下孵育过夜以干燥。在此期间，NGM平板中的IPTG将诱导细菌产生dsRNA。
      1. 每次实验每种细菌培养物至少使用3个培养皿。这将为每次实验提供3个技术重复。
   • 将接种了细菌的干燥NGM-琼脂RNAi平板置于4 °C避光处保存，最多可保存两周。
3. 制备 秀丽隐杆线虫 菌株 BAT28
4. 维持含有转基因的线虫品系 BAT28 otIs305 [hsp-16.2启动子::che-1，rol-6(su1006)] 和 ntIs1 [gcy-5prom::gfp在15 °C条件下，使用标准NGM琼脂平板培养OP50细菌。
   注意： 有关线虫培养的详细方案，请参见。 rol-6(su1006) 是一种显性等位基因，常用作表型注射标记¹⁶ 导致典型的滚动运动。它被用于 otIs305 转基因标记追踪 hsp-16.2prom::che-1.
   1. 始终将 BAT28 菌株保存在 15 °C，以防止其过早激活 hsp-16.2prom::che-1 转基因。在处理该品系时，应尽可能减少暴露于高于15 °C的温度环境。
5. 为了进行线虫的年龄同步化，采用漂白法。
   1. 用 900 µL M9 缓冲液冲洗含有 BAT28 成虫和卵的 6 cm NGM 琼脂平板。在 900 x g 条件下离心 1 分钟以沉淀线虫。弃去上清液。
   2. 加入 0.5–1 mL 漂白液，振荡试管约 1 分钟，直至成虫开始破裂。使用标准体视显微镜进行观察。
   3. 以 900 × g 离心 1 分钟收集虫体，弃上清液。
   4. 将800 µL M9缓冲液加入线虫沉淀中，重悬后在900 x g下离心，重复洗涤3次。
   5. 将清洗后的卵置于接种了OP50细菌的新鲜NGM平板上。在OP50细菌上于15 °C培养经漂白处理的种群，直至其发育至L4期（约4天）。使用标准体视显微镜，可通过观察线虫腹侧约中点处的白色斑块来识别L4期幼虫。
      注意： 通过耗竭实现生殖细胞向神经元转化的表型 lin-53，需要在亲代（P0）中将其耗尽。表型转换的评分在下一代（子代F1）中进行。为实现耗尽 lin-53 在P0代，L4期动物即接受RNAi处理。
6. 手动使用铂金丝将50条L4期线虫转移至不含任何细菌的NGM平板上，每组重复一次，使线虫远离所转移的OP50细菌。让线虫在平板上移动约5分钟。使用先前接种于NGM-琼脂RNAi平板上的细菌 lin-53 将RNAi细菌（或空载体对照）转移至相应的RNAi平板中。
   1. 避免将OP50细菌转移到实际的RNAi平板上。操作需迅速，以尽量减少菌株暴露于高于15 °C温度环境的时间。
7. 在15 °C下将线虫孵育于NGM-琼脂RNAi平板上约7天，直至线虫的F1代子代发育至L3–L4阶段。此时F1代个体可与P0代成虫明显区分，因其体型较F1代更小且更细。
   1. 在体视显微镜下观察F1代子代线虫是否出现突出的阴门（protruding vulva）表型pvul）表型，如图所示 图1. 针对的RNAi lin-53 具有多效性作用并导致 pvul 表型，可用于评估针对RNAi的干预效果 lin-53 已取得成功。
      注意： RNAi 靶向 lin-53 也可能导致F1代胚胎死亡。若在动物发育至L3–L4阶段之前将培养板暴露于高于15 °C的温度下，该效应会增强。死亡胚胎表现为发育停滞且无法孵化。
   2. 将培养板置于避光条件下孵育，因为IPTG对光敏感。

结果

图1：lin-53 RNAi 导致的 Pvul 表型。（上图）来自对照组或经 lin-53 RNAi 处理母体的 F1 代 L4/年轻成虫期子代线虫的微分干涉差（DIC）图像。比例尺 = 20 µm。（下图）经 lin-53 RNAi 处理的线虫表现出外凸型阴门（pvul）表型（黑色箭头）。该 pvul 表型证实针对 lin-53 的 RNAi 干扰成功。比例尺 = 20 µm。 请点击...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>化学试剂&nbsp;</strong>
琼脂，Kobe I	Roth	5210.1
蛋白胨&nbsp;	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media&nbsp;
酵母提取物&nbsp;	AppliChem	A1552,0100
两性霉素B	USBiological	A2220
CaCl₂	Merck Biosciences	208290
胆固醇	Roth	8866.2
明胶	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K₂PO₄	Roth	T875.2
KH₂PO₄	Roth&nbsp;	3904.2
MgSO₄	VWR	25,163,364
Na₂HPO₄	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth&nbsp;	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
羧苄青霉素	Roth	634412
四环素	Roth	2371.2
<strong>培养箱</strong>
培养箱&nbsp;	Sanyo MIR-5	5534210	用于在 15 &deg;C 或 25 &deg;C 下维持线虫品系
<strong>显微镜</strong>
体视显微镜	SMZ745	Nikon
<strong>细菌菌株</strong>
大肠杆菌 HT115			F-，mcrA，mcrB，IN(rrnD-rrnE)1，rnc14::Tn10(DE3 溶原：lavUV5 启动子 - T7 聚合酶)（IPTG 诱导型 T7 聚合酶）（RNAseIII 缺陷型）。
大肠杆菌 OP50&nbsp;			尿嘧啶营养缺陷型大肠杆菌菌株
<strong>线虫菌株</strong>
BAT28：&nbsp;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V。			由 OH9846 经与 N2 回交四次获得
<strong>RNAi 克隆</strong>
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer 文库 16B07 染色体I，K07A1.12
空载体：L4440	Addgene&nbsp;	#1654