RNAi 铺板用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）饲喂：一种在大肠杆菌（E. coli）中诱导靶向 dsRNA 表达的技术

摘要

来源：Kolundzic, E., 等. 应用RNA干扰与热激诱导转录因子表达将秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖细胞重编程为神经元. 视觉化实验杂志（J. Vis. Exp.） (2018).

本视频介绍了在C. elegans中进行RNAi治疗的原理，并演示了在转基因线虫品系中敲低lin-35的实验方案。

方案

本方案节选自 Kolundzic， 等 应用RNA干扰与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元 秀丽隐杆线虫, 视觉实验杂志. (2018).

1. 溶液配制
   1. NGM-琼脂平板（1 L）
      1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨培养基（例如 Bacto-Peptone）和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄₄，1 mL 1 M CaCl₂，25 mL 1 M K₂PO₄₄，以及1 mL两性霉素B（2.5 mg/mL 储液）。
   2. NGM-琼脂RNAi平板（1 L）
      1. 加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨培养基和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄

结果

图1：lin-53 RNAi 导致的 Pvul 表型。（上图）来自对照组或经 lin-53 RNAi 处理母体的 F1 代 L4/年轻成虫期子代线虫的微分干涉差（DIC）图像。比例尺 = 20 µm。（下图）经 lin-53 RNAi 处理的线虫表现出外凸型阴门（pvul）表型（黑色箭头）。该 pvul 表型证实针对 lin-53 的 RNAi 干扰成功。比例尺 = 20 µm。 请点击.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>化学试剂&nbsp;</strong>
琼脂，Kobe I	Roth	5210.1
蛋白胨&nbsp;	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media&nbsp;
酵母提取物&nbsp;	AppliChem	A1552,0100
两性霉素B	USBiological	A2220
CaCl₂	Merck Biosciences	208290
胆固醇	Roth	8866.2
明胶	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K₂PO₄	Roth	T875.2
KH₂PO₄	Roth&nbsp;	3904.2
MgSO₄	VWR	25,163,364
Na₂HPO₄	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth&nbsp;	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
羧苄青霉素	Roth	634412
四环素	Roth	2371.2
<strong>培养箱</strong>
培养箱&nbsp;	Sanyo MIR-5	5534210	用于在 15 &deg;C 或 25 &deg;C 下维持线虫品系
<strong>显微镜</strong>
体视显微镜	SMZ745	Nikon
<strong>细菌菌株</strong>
大肠杆菌 HT115			F-，mcrA，mcrB，IN(rrnD-rrnE)1，rnc14::Tn10(DE3 溶原：lavUV5 启动子 - T7 聚合酶)（IPTG 诱导型 T7 聚合酶）（RNAseIII 缺陷型）。
大肠杆菌 OP50&nbsp;			尿嘧啶营养缺陷型大肠杆菌菌株
<strong>线虫菌株</strong>
BAT28：&nbsp;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V。			由 OH9846 经与 N2 回交四次获得
<strong>RNAi 克隆</strong>
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer 文库 16B07 染色体I，K07A1.12
空载体：L4440	Addgene&nbsp;	#1654