在液体培养中进行RNAi饲喂：一种在 C. elegans 中敲低基因表达的高通量方法

摘要

来源：Groh, N. 等。在 Caenorhabditis elegans中研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法。 J. Vis. Exp. (2017)。

RNAi 是一种强大的遗传学工具，可供 C. elegans 研究人员使用。本视频介绍了一种利用液体培养条件处理比平板喂养更多线虫的 RNAi 方法。

方案

本方案节选自 Groh et al， 在 Caenorhabditis elegans中研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法， J. Vis. Exp. (2017)。

1. 通过无性腺动物的液体培养收集针对目的基因进行RNA干扰的年轻与年老动物

注意：某些基因对RNAi的反应可能具有温度依赖性，如先前所述。作为RNAi的替代方法，可将突变基因导入 gon-2(-) 遗传背景中。

1. 液体培养细菌的准备
   1. 通过将4 L LB培养基接种12 mL相应的细菌培养物（向RNAi细菌培养物中添加终浓度为50 µg/mL的羧苄青霉素和1 mM IPTG），在37 °C、180 rpm条件下过夜培养，制备OP50和RNAi细菌（产生目标dsRNA的细菌，以及携带空载体的对照细菌）。
   2. 次日，在4 °C条件下以6,70....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
费恩巴赫培养瓶	Corning	4425-2XL	Pyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹槽
膜用螺口盖	Schott	1E+06	GL45
往复式混合器	VWR	444-0148	是
分液漏斗	Nalgene	4300-1000	容量 1,000 ml
1 ml 注射器	BD Plastipak	3E+05
灰色针头，27 G × ½ "，0.4 mm × 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
膜过滤器 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	否
pH 试纸	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
蛋白酶抑制剂混合液	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free 片剂
辛苯聚醇-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-吗啉乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M1317
壬基酚聚氧乙烯醚	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	重组型，RNase 无活性
RNaseA	Promega	A7973	溶液
总蛋白印迹染色	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby 蛋白印迹染色剂
总蛋白凝胶染色	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby 蛋白凝胶染色剂
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）	Serva	36970
碘乙酰胺	Serva	26710
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	9830
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111
用于相对与绝对定量的同重标签	Sciex	4E+06	iTRAQ 试剂多重试剂盒
Avanti J-26XP 离心机	Beckmann Coulter	4E+05
Optima Max-XP 超速离心机	Beckmann Coulter	4E+05
5424R 离心机	Eppendorf	5E+09
5702 离心机	Eppendorf	6E+09
Megafuge 40R 离心机	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	离心式浓缩仪
荧光体视显微镜 M165 FC	Leica		配备 Planapo 2.0x 物镜
解剖显微镜	Leica		Leica S6E
高倍显微镜 Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		配备 PlanAPOCHROMAT 20x 物镜和 Zeiss Axio Cam MRm
软件
图像分析软件	ImageJ
质谱数据分析	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	否
大肠杆菌菌株
OP50	CGC
RNAi 细菌
L4440	Julie Ahringer RNAi 文库
秀丽隐杆线虫 突变体
CF2253	CGC，菌株名称：EJ1158	基因型： gon-2(q388)
秀丽隐杆线虫 转基因株系
DCD214	中国台湾 DZNE Tübingen Della David 实验室	基因型： N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	中国台湾 DZNE Tübingen Della David 实验室	基因型： daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]