RNAi Feeding in Liquid Culture: A High-Throughput Method to Knockdown Gene Expression in <em>C. elegans</em>

doi:10.3791/20139

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Research Article

液体培养物中的 RNAi 补料:一种敲低秀丽隐杆线虫基因表达的高通量方法

April 30, 2023

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Abstract

来源:Groh， N. et al.研究秀丽隐杆线虫固有蛋白质聚集随年龄变化的方法。J. Vis. Exp.（2017 年）。

RNAi 是秀丽隐杆线虫研究人员可以使用的强大遗传工具。本视频介绍了一种利用液体培养条件用 RNAi 处理比板补料更多蠕虫的方法。

Protocol

该协议摘自 Groh 等人，研究秀丽隐杆线虫固有蛋白质聚集随年龄变化的方法，J. Vis. Exp. （2017）。

1. 无性腺动物的液体培养，收集针对目标基因的 RNAi 的年轻和老年动物

注意:如前所述，一些基因对 RNAi 的反应可能与温度有关。作为 RNAi 的替代方案，突变基因可以掺入 gon-2（-） 背景中。

液体培养的细菌的制备
1. 通过用 12 mL 的相应细菌培养物接种 4 L LB 培养基（向 RNAi 细菌培养物中加入终浓度的 50 μg/mL 羧青霉素和 1 mM IPTG）来制备 OP50 和 RNAi 细菌（产生所需 dsRNA 的细菌和以空载体作为对照的细菌），并在 37 °C 下以 180 rpm 孵育过夜。
2. 4 °C 下以 6,700 x g 收获培养物 10 分钟。去除上清液，并将每个沉淀重悬于 60 mL 冰冷的 S 基础培养基（100 mM NaCl，50 mM 磷酸钾 pH 6，保持在冰上）。将三个重悬的沉淀（OP50，对照RNAi细菌和目标基因的RNAi细菌）保持在4°C，直到步骤1.2.
  注意:蠕虫可以从 L1 阶段开始在 RNAi 上生长，或者为了避免最后一个幼虫阶段 L4 的发育缺陷（参见步骤 1.2）。
最后的幼虫阶段 L4 开始用 RNAi 处理的液体培养物
1. 在 Fernbach 培养瓶（容量 2,800 mL）中加入 200 mL S 基础培养基。对于最终培养体积为 300 mL（参见 1.2.2.4），加入 10 mM 柠檬酸钾，pH 6,3 mL 痕量金属溶液（5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、2.5 mM FeSO₄、1 mM MnCl₂、1 mM ZnSO₄、0.1 mM CuSO₄）、3 mM MgSO₄、3 mM CaCl₂、100 ng/mL 多菌灵和 5 μg/mL 胆固醇）。用膜螺帽盖住培养瓶。有关缓冲液的配方，请参阅表 1。
2. 将 L1 从 25 °C 中取出并转移到 15 mL 试管中。以 1,900 x g 离心 3 分钟，去除上清液，并计数每 2 μL 的 L1。将 500,000 个 L1 添加到上一步制备的 Fernbach 培养瓶中。
3. 根据蠕虫的数量按比例添加 OP50（从步骤 1.1 开始）。例如，对于 500,000 个蠕虫，添加 60 mL OP50。
4. 用 S 基础完成蠕虫培养，使总体积达到 300 mL。将蠕虫培养物在 25 °C 下在 150 rpm 的振荡培养箱中孵育至 L4 阶段。
5. 第二天，蠕虫应该达到野生型 L4 的大小。要从 OP50 细菌转变为 RNAi 细菌，将动物收集在六个 50 mL 管中，让它们沉淀并去除上清液。用 M9 洗涤 L4 以去除残留的 OP50 细菌:以 1900 x g 离心 3 分钟，去除上清液并将所有 L4 转移到一个 50 mL 管中。计算每 5 μL 的 L4s（至少 9 次）。年轻的蠕虫集合需要两倍的 50,000 个 L4，老化的蠕虫集合需要两倍的 100,000 个 L4。
6. 如 1.2.2.1 中所述准备四个 Fernbach 培养瓶。向每个培养瓶中加入终浓度为 50 μg/mL 羧青霉素和 1 mM IPTG。
7. 根据蠕虫的数量按比例添加目标基因的对照 RNAi 细菌和 RNAi 细菌（来自步骤 1.1）:对于每个培养瓶添加 7 mL 的相应细菌（对于幼虫），每个培养瓶添加 14 mL 的相应细菌（对于老化的蠕虫）。
8. 对于年轻的蠕虫收集，每个培养瓶添加 50,000 条蠕虫，对于每个培养瓶添加 100,000 条蠕虫，对于老化的蠕虫收集，并用 S 基础完成培养，以填充至 300 mL。在 25 °C 和 150 rpm 下孵育蠕虫培养物（总共四种）。

2. 秀丽隐杆线虫液体培养物的维持

定期从每种液体培养物中收集等分试样，并放在载玻片上（或者放在琼脂板上）以验证没有污染。使用解剖显微镜检查培养物中的细菌食物水平，尤其是在生长期。如步骤 1.1 中所述，提前准备 2 L 对照 RNAi 细菌和目标基因的 RNAi 细菌培养物。如有必要，将这些添加到秀丽隐杆线虫液体培养物中，并将其余部分保持在 4 °C。
定期检查动物是否不育。大多数动物不会有性腺。根据 gon-2 突变的外显率，一些可能已经流产了性腺结构，但不应观察到有卵的动物。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 储备液 量 最终浓度 评论/描述 S 基础（500 mL:5.9 g NaCl，
50 mL 1 M 磷酸钾 pH 6） 200 毫升 1 M 磷酸钾 pH 6:1 L 时:129 g KH2PO4 二元，
52 g K2HPO4 无水氢氢化合物 1 M 柠檬酸钾 pH 6
（400 mL:13.1 g 柠檬酸一水合物，
134.4 克柠檬酸三钾一水合物） 3 毫升 10 毫米痕量金属溶液
（1 L 份:1.86 g 乙二胺四乙酸（EDTA），
0.69 克硫酸铁4 ·7 H2O，
0.2 克 MnCl2 ·4 H2O，
0.29 克 ZnSO4 ·7 H2O，
0.025 克 CuSO4 ·5 H2O） 3 毫升将储备溶液储存在4°C的黑暗中 1 M MgSO 4 （500 mL时:123.3 g） 900 微升 3 毫米 1 M CaCl 2 （500 mL时:73.5 g） 900 微升 3 毫米 200 μg/mL 碳菌灵
（50 mL:10 mg 甲醇溶液） 150 微升 100 纳克/毫升 5 毫克/毫升胆固醇
（100 mL:0.5 g 乙醇溶液） 300 微升 5 微克/毫升

表 1.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> Fernbach 培养瓶康宁 4425-2XL 型 Pyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹痕是的膜螺口盖肖特 1E+06 GL45 系列是的章动搅拌机 VWR 444-0148 是的分液漏斗 Nalgene 公司 4300-1000 元容量 1,000 ml 不 1 毫升注射器 BD 塑料包装机 3E+05 不灰色针头，27 G x 1/2 "，0.4 mm x 13 mm BD Microlance 3 显微镜 3E+05 不膜过滤器 0.025 μM 米利波尔 VSWP04700 不 pH 试纸 Machery-Nagel 92110 pH 固定 0-14 不蛋白酶抑制剂混合物罗氏 5E+09 完全不含 EDTA 的迷你片剂不辛氧醇醚-9 应用编号 A1388 海卫一 X-100 不 4-吗啉乙磺酸（MES）西格玛-奥德里奇货号 M1317 不壬基苯基聚乙烯二醇应用编号 A1694 诺尼德 P40 （NP40）不 DNaseI 罗氏 5E+09 重组，无 RNase 不核糖核酸酶 A 普罗梅加编号 A7973 溶液不总蛋白印迹染色赛默飞世尔 S11791 系列 Sypro Ruby 蛋白质印迹染色剂不总蛋白凝胶染色赛默飞世尔 S12001 系列 Sypro Ruby 蛋白质凝胶染料不 TCEP（三（2-羧乙基）盐酸膦）塞尔瓦 36970 不碘乙酰胺塞尔瓦 26710 不碳酸氢铵西格玛-奥德里奇 9830 元不测序级改良胰蛋白酶普罗梅加 V5111 型不用于相对和绝对定量的同量异位标签赛克斯 4E+06 iTRAQ 试剂多重试剂盒不离心机 Avanti J-26XP 贝克曼·库尔特 4E+05 是的超速离心机 Optima Max-XP 贝克曼·库尔特 4E+05 不离心机 5424R Eppendorf 埃本多夫 5E+09 是的离心机 5702 Eppendorf 埃本多夫 6E+09 是的 Megafuge 40R 离心机 Thermo Scientific 公司 8E+07 不 Concentrator Plus 集中器 Eppendorf 埃本多夫 5E+09 离心蒸发器不荧光体视显微镜 M165 FC 徕卡使用 Planapo 2.0x 物镜不解剖显微镜徕卡徕卡 S6E 是的高倍率显微镜 Zeiss Axio Observer Z1 蔡司配备 PlanAPOCHROMAT 20 倍物镜和蔡司 Axio Cam MRm 不软件不图像分析软件图像J 不质谱数据分析 Protein Prospector http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm 不大肠杆菌菌株 OP50 CGC公司 RNAi 细菌 L4440 系列 Julie Ahringer RNAi 文库秀丽隐杆线虫突变体 CF2253 系列 CGC，菌株名称:EJ1158 基因型: gon-2（q388）秀丽隐杆线虫转基因 DCD214型 Della David 在 DZNE 图宾根的实验室基因型: N2;uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1] DCD215 系列 Della David 在 DZNE 图宾根的实验室基因型: daf-2（e1370） III;uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

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液体培养物中的 RNAi 补料:一种敲低<em>秀丽隐杆线虫</em>基因表达的高通量方法