在液体培养中进行RNAi饲喂：一种在 C. elegans 中敲低基因表达的高通量方法

摘要

来源：Groh, N. 等。在 Caenorhabditis elegans中研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法。 J. Vis. Exp. (2017)。

RNAi 是一种强大的遗传学工具，可供 C. elegans 研究人员使用。本视频介绍了一种利用液体培养条件处理比平板喂养更多线虫的 RNAi 方法。

方案

本方案节选自 Groh et al， 在 Caenorhabditis elegans中研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法， J. Vis. Exp. (2017)。

1. 通过无性腺动物的液体培养收集针对目的基因进行RNA干扰的年轻与年老动物

注意：某些基因对RNAi的反应可能具有温度依赖性，如先前所述。作为RNAi的替代方法，可将突变基因导入 gon-2(-) 遗传背景中。

1. 液体培养细菌的准备
   1. 通过将4 L LB培养基接种12 mL相应的细菌培养物（向RNAi细菌培养物中添加终浓度为50 µg/mL的羧苄青霉素和1 mM IPTG），在37 °C、180 rpm条件下过夜培养，制备OP50和RNAi细菌（产生目标dsRNA的细菌，以及携带空载体的对照细菌）。
   2. 次日，在4 °C条件下以6,700 × g离心10分钟收集菌体。弃去上清液，将每种菌体沉淀重悬于60 mL冰上预冷的S基础培养基（100 mM NaCl，50 mM磷酸钾，pH 6，置于冰上）。将三种重悬的菌体沉淀（OP50、对照RNAi细菌和目标基因的RNAi细菌）置于4 °C保存，直至进行步骤1.2。
      注意：可从L1阶段开始用RNAi培养线虫，或为避免发育缺陷，从最后的幼虫阶段L4开始进行RNAi处理（见步骤1.2）。
2. 从最后幼虫阶段L4开始的RNAi处理液体培养
   1. 在Fernbach培养瓶（容量2,800 mL）中加入200 mL S基础培养基。为达到最终300 mL的培养体积（见1.2.2.4），加入10 mM柠檬酸钾（pH 6）、3 mL微量元素溶液（5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、2.5 mM FeSO₄、1 mM MnCl₂、1 mM ZnSO₄、0.1 mM CuSO₄）、3 mM MgSO₄、3 mM CaCl₂、100 ng/mL多菌灵和5 µg/mL胆固醇。用膜密封的螺旋盖封闭培养瓶。缓冲液配方参见 表1 。
   2. 将L1线虫从25 °C取出，转移至15 mL离心管中。以1,900 × g离心3分钟，弃去上清液，计数每2 µL中的L1数量。将500,000条L1线虫加入前一步准备好的Fernbach培养瓶中。
   3. 根据线虫数量按比例加入OP50（来自步骤1.1）。例如，对于500,000条线虫，加入60 mL OP50。
   4. 用S基础培养基补足线虫培养体系至总体积300 mL。将线虫培养物置于25 °C、150 rpm的摇床培养箱中，培养至L4阶段。
   5. 次日，线虫应达到野生型L4阶段的大小。为将细菌从OP50更换为RNAi细菌，将线虫收集至六个50 mL离心管中，静置沉降后弃去上清液。用M9缓冲液洗涤L4线虫以去除残留的OP50细菌：以1,900 × g离心3分钟，弃去上清液，将所有L4线虫转移至一个50 mL离心管中。每5 µL计数一次L4数量（至少重复九次）。年轻线虫收集需两份各50,000条L4线虫，衰老线虫收集需两份各100,000条L4线虫。
   6. 按照1.2.2.1所述准备四个Fernbach培养瓶。每个培养瓶中还需添加终浓度为50 µg/mL的羧苄青霉素和1 mM IPTG。
   7. 根据线虫数量按比例加入对照RNAi细菌和目标基因的RNAi细菌（来自步骤1.1）：每个培养瓶中，年轻线虫组加入7 mL相应细菌，衰老线虫组加入14 mL相应细菌。
   8. 每个培养瓶中分别加入50,000条线虫用于年轻线虫收集，或100,000条线虫用于衰老线虫收集，并用S基础培养基补足至300 mL。将共四个线虫培养瓶置于25 °C、150 rpm条件下培养。

2. 维持 秀丽隐杆线虫 液体培养物

1. 定期从每种液体培养物中取等分试样，置于载玻片上（或 alternatively 置于琼脂平板上），以确认无污染。使用解剖显微镜检查培养物中的细菌食物水平，尤其在生长阶段期间。按照步骤 1.1 所述，预先制备 2 L 的对照 RNAi 细菌和针对目标基因的 RNAi 细菌培养物。如有需要，将其加入 C. elegans 液体培养物中，并将剩余部分保存于 4 °C。
2. 定期检查动物是否为无菌状态。大多数动物将不具有性腺。根据 gon-2 突变的外显率，部分动物可能具有退化的性腺结构，但不应观察到任何携带卵的个体。

储存液	用量	终浓度	备注/说明
S 基础培养液（配制 500 mL：5.9 g NaCl， 50 mL 1 M 磷酸钾缓冲液 pH 6）	200 mL		1 M 磷酸钾缓冲液 pH 6：配制 1 L：129 g KH2PO4 一碱， 52 g K2HPO4 二碱无水
1 M 柠檬酸钾 pH 6 （配制 400 mL：13.1 g 一水柠檬酸， 134.4 g 一水三柠檬酸钾）	3 mL	10 mM
微量元素溶液 （配制 1 L：1.86 g 乙二胺四乙酸（EDTA）， 0.69 g FeSO4 · 7 H2O， 0.2 g MnCl2 · 4 H2O， 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O， 0.025 g CuSO4 · 5 H2O）	3 mL		将储存液避光保存于 4 °C
1 M MgSO4 （配制 500 mL：123.3 g）	900 µL	3 mM
1 M CaCl2 （配制 500 mL：73.5 g）	900 µL	3 mM
200 µg/mL 多菌灵 （配制 50 mL：10 mg 溶于甲醇）	150 µL	100 ng/mL
5 mg/mL 胆固醇 （配制 100 mL：0.5 g 溶于乙醇）	300 µL	5 µg/mL

表1.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
费恩巴赫培养瓶	Corning	4425-2XL	Pyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹槽
膜用螺口盖	Schott	1E+06	GL45
往复式混合器	VWR	444-0148	是
分液漏斗	Nalgene	4300-1000	容量 1,000 ml
1 ml 注射器	BD Plastipak	3E+05
灰色针头，27 G × ½ "，0.4 mm × 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
膜过滤器 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	否
pH 试纸	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
蛋白酶抑制剂混合液	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free 片剂
辛苯聚醇-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-吗啉乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M1317
壬基酚聚氧乙烯醚	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	重组型，RNase 无活性
RNaseA	Promega	A7973	溶液
总蛋白印迹染色	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby 蛋白印迹染色剂
总蛋白凝胶染色	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby 蛋白凝胶染色剂
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）	Serva	36970
碘乙酰胺	Serva	26710
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	9830
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111
用于相对与绝对定量的同重标签	Sciex	4E+06	iTRAQ 试剂多重试剂盒
Avanti J-26XP 离心机	Beckmann Coulter	4E+05
Optima Max-XP 超速离心机	Beckmann Coulter	4E+05
5424R 离心机	Eppendorf	5E+09
5702 离心机	Eppendorf	6E+09
Megafuge 40R 离心机	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	离心式浓缩仪
荧光体视显微镜 M165 FC	Leica		配备 Planapo 2.0x 物镜
解剖显微镜	Leica		Leica S6E
高倍显微镜 Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		配备 PlanAPOCHROMAT 20x 物镜和 Zeiss Axio Cam MRm
软件
图像分析软件	ImageJ
质谱数据分析	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	否
大肠杆菌菌株
OP50	CGC
RNAi 细菌
L4440	Julie Ahringer RNAi 文库
秀丽隐杆线虫 突变体
CF2253	CGC，菌株名称：EJ1158	基因型： gon-2(q388)
秀丽隐杆线虫 转基因株系
DCD214	中国台湾 DZNE Tübingen Della David 实验室	基因型： N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	中国台湾 DZNE Tübingen Della David 实验室	基因型： daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]