四通道嗅觉仪检测：一种评估气味线索诱导反应的方法 果蝇

摘要

来源：Lin, C.C., 等 通过计算机追踪果蝇在四象限嗅觉仪中的嗅觉行为分析 果蝇 四象限嗅觉仪中. J. Vis. Exp. (2016).

果蝇具有复杂的嗅觉系统，能够区分数百种气味分子，并利用嗅觉来指导其行为决策。本视频介绍了四通道嗅觉仪检测法，这是一种研究果蝇嗅觉行为反应的方法。视频重点展示了如何处理待测果蝇，以及在实施检测过程中的关键步骤。

方案

本方案节选自 Lin 等人 通过计算机追踪果蝇在四象限嗅觉仪中的嗅觉行为分析 果蝇 在四象限嗅觉仪中 J. Vis. Exp. (2016).

1. 对吸引性和驱避性气味物质的行为反应

1. 打开温度控制器并将其设定为 25 °C.
2. 将气味室（对照和测试气味）通过导管连接至行为箱的推入式接口，导管一端插入气味室出口，另一端连接行为箱上的推入式接头。
3. 使用气流计检查每个象限的流速，确保对照和气味气流均等于100 ml/min。
4. 用70%乙醇对PTFE蝇行为 arena 和玻璃板进行2-3次清洁，并使其完全风干（约3-4分钟）。
5. 用夹子将玻璃板固定在实验区域上。
6. 转移果蝇时避免使用 CO₂ 通过其中一块玻璃板上的孔将麻醉气体通入实验区域。转移完成后，在孔上放置圆形金属网，以防止果蝇逃逸。
   注意： CO₂ 麻醉已被证明会影响 果蝇 行为，且不应在行为学实验前24小时内使用。
7. 将装有果蝇的实验 arena 置于避光暗室中，通过将连接在行为箱快接接头上的管路与 arena 四个角落相连，接入四路控制气流，关闭暗室门，静置 10–15 分钟，使果蝇适应新环境。若条件允许，关闭实验所在房间的照明，以避免可能的微弱光线泄漏对实验结果造成偏差。
8. 运行一个5-10分钟的对照实验，使果蝇暴露于4股对照气流中。
9. 立即分析数据（参见下方数据分析部分），以确保果蝇在实验区域内分布均匀，且吸引指数接近 0。此步骤至关重要，因为它可验证实验区域内是否存在未受控的偏好或回避因素例如 外部光线泄漏、温度分布不均、实验区域不平整、气味污染 等等。如果果蝇分布不均或运动活性较低，应弃用这些果蝇，再次清洁实验区域（步骤1.4），并使用新的一批果蝇重复实验。
10. 通过打开三通阀或重新插接连接管，将测试气味室与装置连接。
11. 运行测试实验5-10分钟，并按照下文第2节所述分析数据（图1记录时间超过20分钟可能导致数据文件过大，难以进行计算处理。若需进行更长时间的实验记录，可快速停止并重新启动追踪程序，这将导致实验记录之间出现约10秒的间隔。
12. 弃去果蝇。
13. 用70%乙醇清洁实验区域和玻璃板（步骤1.4），并在避光 enclosure 内更换连接管。为加快实验进度，可使用一个新的清洁实验区域，同时在进行实验运行时清洗脏的实验区域。
14. 如有需要，使用新的一批果蝇重复实验。若在同一天进行多个实验，需格外注意确保系统中无前次实验残留的气味剂。通常情况下，低浓度气味剂或CO₂但对于高浓度刺激物，两次实验之间可能需要长达24小时的间隔。此外，若在对照实验中怀疑存在气味污染，可更换流量管之后的所有管路。每次实验之间应始终保持干燥空气流通，以持续冲洗系统。

2. 数据分析

注意： 建议使用的果蝇追踪采集软件（详见材料部分）可在采集过程中实时追踪果蝇，并以 *.dat 格式保存所有被检测果蝇的时间戳和坐标。我们开发了定制的 Matlab 程序，用于将数据转换为 Matlab 格式并进行数据分析。补充材料中提供了代码示例，但具体实现细节将取决于所使用的数据采集软件。

1. 加载原始数据。创建一个沿 arena 轮廓的空间掩膜，并将该掩膜应用于原始数据，以去除所有位于 arena 外部的数据点，因为这些数据代表噪声（图 2A，补充代码 MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m）。
2. 去除所有移动速度低于 0.163 cm/s 且持续时间超过 3 秒的数据点，因为这些数据很可能是噪声或由静止不动的果蝇产生的（图 2B，补充代码 TemporalFiltering.m）。
3. 通过一次性绘制所有剩余数据点或绘制单个轨迹来可视化结果（图 1，补充代码 SingleTrajectoryViewer.m）。
   注意： 四区域中的气味边界位置可能取决于多种因素，例如每种气味分子的特性以及所使用的气流速率。例如，高挥发性气味分子可能比低挥发性气味分子更充分地充满其所在象限。因此，每种气味分子可能表现出略微不同的气味边界。使用光离子化检测器测量气味边界可能存在干扰，因为它通过真空方式从特定位置采样空气，从而破坏该位置的气味浓度。尽管如此，仍可根据果蝇行为数据快速估算气味边界。例如，在 图 1C 和 1D 中，基于累积的果蝇轨迹可以清晰观察到不同气味刺激下的气味边界。
4. 计算吸引指数（Attraction Index, AI），以确定对照实验是否产生无偏好反应，并评估对气味分子（或光遗传学）刺激的响应。计算吸引指数（AI）时，使用对照或测试记录的最后 5 分钟数据。为获得一个介于 +1（完全吸引）和 -1（完全排斥）之间的吸引力度量值，采用以下公式计算 AI：
   
   其中 N_test 表示测试象限中的数据点数量，N_control 表示三个对照象限中数据点数量的平均值。该指标具有直观性，接近零的值表示无偏好。然而，它并不能准确反映位于气味分子象限中果蝇总数的比例。为获得这一度量，可使用比例指数（Percentage Index, PI）：
   
   其中 N_test 表示测试象限中的数据点数量，N_total 表示四个象限中所有数据点的总数。该公式提供的度量值介于 0 和 1 之间，0.25 对应于无行为偏好（图 1E 和 2C，补充代码 AttractionIndex.m）。
5. 每种实验条件重复进行 5–10 次，每次使用一组新的果蝇。使用 Kolmogorov-Smirnov 非参数检验比较不同条件之间或与对照组之间的吸引指数（图 1F，Matlab 中的 kstest2 函数）。

结果

图1：四区域嗅觉实验生成的示例数据。（A）四区域实验区域示意图。（B）当四个象限均仅通入干燥空气时，观察到中性反应。（C）对左上象限通入的6.25%稀释苹果醋产生的吸引反应。（D）由10%丙酸乙酯引发的排斥行为。在图2B-2D中，绘制了采集数据中的单条轨迹。使用颜色梯度表示记录的时间进程，其中蓝色和红色分别代表记录的起始和结束。（E）吸引指数（AI）与百分比指数（PI）的比较。（F）无气味（对照）、苹果醋（ACV）和10%丙酸乙酯（EP）在3至6次实验中的平均AI值。误差线表示标准误（SEM）。统...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>气流输送系统</strong>			<strong>（所需数量）</strong>
<em><strong>管路与连接件</strong></em>
热塑性NPT(F)歧管	Cole-Parmer，IL，美国	R-31522-31	1
六角减径管接头（1/4MNPT->1/8MNPT	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5232T314	1
管路（内径：1/8）	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5108K43	50 英尺
管路（内径：1/16）	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	52355K41	100 英尺
带倒刺的管路接头	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5117K71	1 包
快接式管路接头	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5779K102	4
带倒刺管接头（1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5463K439	1 包（10 个）
带倒刺管接头（1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5463K438	2 包（10）
带倒刺管接头（1/8MNPT->1/16BF	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5463K4	2 包（10）
带倒刺管接头（1/4MNPT->1/4BF	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	5670K84	1
六角头塞	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	48335K152	1
<em><strong>空气压力调节器、空气过滤器和流量计</strong></em>			<strong>（所需数量）</strong>
实验室气体干燥装置	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, 美国	型号：L68-NP-303；货号 #26840	1
150 mm 流管用多管架	Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国	R03215-30	1
用于150 mm流管的多管架	Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国	R03215-76	1
150 mm 流管	Cole-Parmer，伊利诺伊州，美国	R-03217-15	9
阀盒	Cole-Parmer，IL，美国	R-03218-72	9
精密空气调节器	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	6162K13	1
电磁阀	Automate Scientific，加利福尼亚州伯克利	02-10i	4
电磁阀控制器	ValveLink 8.2，Automate Scientific，Berkeley，CA	18-1月	1
电子流量计	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ（NI USB-6009，National Instruments）和一个	National Instruments	NI USB-6009	1
电源	Extech Instruments	382200	1
气味室
聚丙烯广口瓶，2盎司；60毫升	Nalgene	562118-0002	每次实验至少需要5个，但每种气味剂的每种稀释度均需使用独立的容器。产品可于 Container Store 购买，货号 #635114）
玻璃气味室，0.25 盎司	日晕瓶	LB4B	每次实验至少需要5个
"在" 气味室阀门	Smart Products, Inc.，加利福尼亚州，美国	214224PB-0011S000-4074	每个气味室使用其中一个部件，但需要频繁更换
"出" 气味室阀门	Smart Products, Inc.，加利福尼亚州，美国	224214PB-0011S000-4074	每个气味室使用一个该部件，但需频繁更换
O型圈	RT Dygert 国际公司，明尼苏达州，美国	AS568-029 Buna-N O型圈	1 包（100 个）
<em><strong>果蝇行为箱、相机和行为观测 arena</strong></em>			<strong>（所需数量）</strong>
行为与摄像箱材料	Interstate plastics, CA, USA	ABS黑色挤出（<a href="https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php" 目标="空白">https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php</a>)	1803 平方英寸
用于果蝇实验区和气味室插件的聚四氟乙烯材料，3/8" 厚，12" ×12"	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	8545K27	1
玻璃板，1/8" 厚，9" x 9"	McMaster-Carr，伊利诺伊州，美国	8476K191	2
双作用热电控制器	WAtronix Inc, CA, 美国	DA12V-K-0	1
红外LED阵列	Advanced Illumination，美国佛蒙特州罗切斯特	AL4554-88024, PS24-TL	2 个 LED 阵列和 1 个电源
空调机组	Melcor Store	MAA280T-12	1
<em><strong>成像系统</strong></em>			<strong>（所需数量）</strong>
Cosmicar/Pentax C21211TH（12.5 mm F/1.4）C接口镜头	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N 互连电缆	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国	SOCCXC12P05N	1
DC-700 相机适配器	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR 滤光片	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, 美国	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm 圆形偏振镜	亚马逊		1
红外摄像机	Industrial Vision Source，佛罗里达州，美国	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB视频转换器	The Imagingsource，北卡罗来纳州，美国	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2（果蝇追踪软件）	Julian Brown，美国加利福尼亚州斯坦福：julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture 软件	The Imagingsource，北卡罗来纳州，美国	(<a href="https://www.theimagingsource.com/" 目标="空白">http://www.theimagingsource.com/</a>)
<strong>其他</strong>			<strong>（所需数量）</strong>
Dremel 旋转工具	Dremel，Racine，WI，USA	Dremel 8000-03	1
用于玻璃切割的金刚石涂层钻头	可从多家供应商处获取；MSC工业供应公司，纽约州梅尔维尔	90606328	1