活体显微注射 果蝇 胚胎：向发育中胚胎早期递送试剂

摘要

来源：Brust-Mascher, I.，Scholey, J. M. 研究有丝分裂的显微注射技术 黑腹果蝇 合胞体胚胎. 视频实验杂志 (2009).

本视频介绍了如何对活体黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行显微注射，以将试剂导入其中。研究人员可在胚胎发育早期利用该方法引入外源性物质，如核酸和蛋白质。本视频展示的实验方案详细演示了如何准备并实施可溶性试剂的注射操作——此处以用于活体成像实验的荧光蛋白为例。

方案

本方案节选自 Brust-Mascher 和 Scholey 用于研究有丝分裂的显微注射技术 黑腹果蝇 合胞体胚胎, 视觉实验杂志. (2009).

配方：

葡萄汁平板：

• 5.5 g 细菌培养用琼脂（bacto agar）

• 14.5 g 右旋糖或葡萄糖（dextrose or glucose）

• 7.15 g 蔗糖（sucrose）

• 45 ml 葡萄汁浓缩液（100% 果汁）

• 204.5 ml H₂O

• 625 μl 10N NaOH

混合所有成分，微波加热至沸腾。
加入 2.8 ml 酸混合液（酸混合液：20.9 ml 丙酸，2.1 ml 磷酸，27 ml H₂O）

混合后倒入35 mm的培养皿中。在室温下静置一至两天，使其凝固。若培养皿不立即使用，可用封口膜密封，并于4 °C保存（使用前需恢复至室温）。

酵母糊：
将约一茶匙酵母（Sigma YSC2，酿酒酵母 II 型）溶于水中，制成浓稠糊状。使用前，在每块葡萄汁平板上放置少量该糊状物。

注射缓冲液：

• 150 mM K-天冬氨酸盐

• 10 mM K-磷酸盐

• 20 mM 咪唑，pH 7.2

庚烷胶水：
将双面胶带展开并放入100 ml瓶中，加入约50 ml庚烷，密封瓶口，摇晃数天。使用时若胶水过稠，可添加庚烷稀释。

脱水室：
取一个100 mm的培养皿，将一个35 mm培养皿的一部分放入其中以制成 "表格" 并在其周围加入干燥剂（无水硫酸钙），使干燥剂的高度不超过 "表格" 并盖上盖玻片。将带有胚胎的盖玻片放置于此处 "表格" 注射前需进行脱水处理。建议至少使用部分变色指示型Drierite，并在其变色后及时更换。

实验方案：
该方案可用于将几乎任何可溶性试剂注入果蝇合胞体胚胎中：例如，用于观察的荧光蛋白，或靶蛋白抑制剂，或两者同时注入。

1. 胚胎收集

1. 将一个新的葡萄汁培养皿放入产卵笼中。
2. 一小时后取出该培养皿，这是当天的第一次收集，通常质量较差，可予以丢弃。
3. 每小时更换一次培养皿，持续收集胚胎，每次收集时长为一小时。

2. 盖玻片准备

1. 将一个 50 × 22 mm 的盖玻片放置在载玻片的一侧。用胶带将盖玻片的四个角固定在载玻片上，防止其移动。
2. 使用棉签，在盖玻片上沿一条线均匀涂布一层庚烷胶水（胶水不应过于黏稠，且应在几秒内干燥；若未达到此状态，则需加入更多庚烷）。
3. 在载玻片上靠近盖玻片的一侧贴上一段双面胶带。

3. 胚胎制备

注意：应在开始收集后约2小时对胚胎进行成像，因此请安排足够时间，在此时间范围内完成以下步骤。

1. 用湿润的毛笔小心地从葡萄汁培养基上拾取胚胎，并将其放置在载玻片的双面胶带上。
2. 使用镊子的外侧部分，在双面胶带上滚动胚胎，直至其卵壳（外层膜）破裂打开。
3. 轻轻滚动胚胎使其附着在卵壳上，然后用镊子夹起胚胎，将其长轴与盖玻片的长边平行地放置在盖玻片的庚烷胶上。每行排列10至20个胚胎。
4. 取下盖玻片，放入脱水室中脱水3至8分钟（具体时间取决于室内湿度和待注射样本量）。
5. 将盖玻片置于涂有真空油脂的金属腔室上。
6. 用卤代烷油700覆盖胚胎，以防止进一步脱水。此时胚胎已准备好进行显微注射。

4. 胚胎注射

1. 在16倍物镜下找到胚胎。
2. 将胚胎移开，并在不改变焦平面的情况下找到针尖。
3. 将针尖居中，并在不沿x或y方向移动的情况下将其向上移动。
4. 如果针尖未打开，将盖玻片边缘置于视野中（但不要放在针尖将要到达的位置），然后将针尖降至同一焦平面。非常小心地移动盖玻片，直到其接触到针尖并轻轻将其打开。如果针尖已打开，则进入第5步。（针尖可在填充前用氢氟酸处理打开）。
5. 将胚胎移入视野（但不要放在针尖将要到达的位置），将针尖插入油中，并确保从针尖形成良好的液滴。
6. 小心而稳定地将胚胎移向针尖，向胚胎内注入一滴液体，然后将胚胎移开。（或按照注射装置的说明操作）。
7. 所有胚胎注射完成后，即可用于共聚焦显微镜观察。