来源：Sun, Y., 等 基于光斑的检测方法用于分析 黑腹果蝇 幼虫趋光性. J. Vis. Exp. (2019).
Drosophila 幼虫对光敏感，会对周围光照的变化产生反应。本视频介绍了一种检测其避光能力的实验方法，称为光斑实验。该方案展示了如何使用蓝色LED光源建立实验装置，并演示了如何记录动物在接触光线时的行为反应。
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方法文章
光斑检测法：一种用于研究的实验方法 果蝇 趋光行为
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
本实验方案文本节选自 Sun 等 基于光斑的分析检测方法 黑腹果蝇 幼虫趋光性 视频实验杂志 (2019).
1. 成像系统的设置
- 使用铁夹将一个高分辨率网络摄像头夹住，固定在桌面光斑上方约 10 cm 处（图 1）。
- 调整摄像头镜头方向，使其对准桌面。通过 USB 接口将摄像头连接至计算机。
- 将一个琼脂平板放置在摄像头正下方的桌面上。
- 在运行 Windows 7 系统的计算机上打开 "Amcap9.22" 软件，AMcap 窗口中将自动显示光斑图像。轻微左右移动摄像头，确保光斑位于窗口中央附近。确保摄像头不会遮挡光路，光斑应完整且呈圆形。
注意： 该软件可在 http://amcap.en.softonic.com/ 获取。 - 使用夹子将一个 850 nm ± 3 nm 带通滤光片固定在摄像头正下方 5–7 mm 处。
注意： 滤光片直径约为 2.5 cm，而摄像头镜头直径小于 1 cm，因此滤光片可完全覆盖摄像头的视野。安装滤光片后，AMcap 窗口中不应再看到光斑。 - 将三个红外发光 LED（中心波长 = 850 nm）均匀布置在琼脂平板周围。每个 LED 距琼脂平板边缘约 5 cm，LED 镜头面应向下倾斜 70° 对准琼脂平板。通过交流转直流电源适配器为 LED 供电。
注意： 建议固定红外 LED 的位置和角度，以确保多次实验中光照场亮度的一致性，并便于后续视频处理。 - 在计算机与装置之间放置一块黑板，并调低计算机屏幕亮度，防止屏幕光线干扰实验。
注意： 在测量光的波长或强度时，应保持环境黑暗。
2. 设置成像参数
- 在 AMcap 软件菜单中，选择 选项 | 视频设备 | 捕获格式，并将所捕获视频的像素尺寸设置为 800 x 600，帧率为 60 fps。
- 取下摄像头下方的滤光片，在摄像头下方放置一把刻度尺，调节摄像头焦距，使刻度线清晰且与视频视野的宽度方向平行。
- 点击 捕获 | 设置 | 视频捕获 以选择保存路径，点击 开始录制，记录对应 600 像素的实际距离，并计算每个像素对应的实际距离比例。
3. 光回避行为的视频记录
- 所有实验过程中保持温度为 25.5 °C。如有需要，使用空调控制室温。使用加湿器将湿度恒定维持在 60%。
- 拍摄一段名为 "lightarea1" 的光斑位置短视频。然后，将 850 nm ± 3 nm 滤光片移回以遮盖相机镜头。
注意：记录幼虫行为时，相机镜头被 850 nm ± 3 nm 滤光片覆盖，以确保光斑不会出现在视频中。后续可通过 Matlab 在包含幼虫的视频中重建光斑位置。请勿移动相机位置，并避免更改第 2.3 步中测得的每个像素与实际距离之间的比例。 - 打开远离实验装置的光源（例如房间照明灯），并将灯光调至尽可能低的亮度，以确保肉眼仍能清晰观察到幼虫。用勺子将幼虫从培养基中取出，轻柔地挑选一只三龄幼虫，并用蒸馏水将其清洗干净。注意每次只清洗一只幼虫，以避免饥饿状态对实验造成干扰。单次实验至少需要 20 只幼虫。
- 将幼虫转移至第 1.3 步中放置于相机正下方的琼脂平板中心。使用毛笔轻轻去除幼虫表面多余的水分，或用吸水纸吸干水分，以防止镜头下产生光线反射。关闭房间照明灯，让幼虫在黑暗环境中适应 2 分钟。
- 打开 LED 光源以产生红外光，并用毛笔轻柔地将幼虫引导至平板中心。当幼虫开始直线爬行时，旋转平板使其头部朝向光斑方向。确保其从起点即沿直线爬行，否则可能无法成功接近光斑。
- 点击 采集 | 设置 | 视频采集 以选择保存路径，然后点击 开始录制 进行记录。让幼虫向光斑爬行，进入光斑区域，随后离开光斑直至几乎移出视野范围，再点击 停止录制。若幼虫在接近光斑前即转向远离，则直接点击 停止录制。
- 将滤光片从相机前移开。拍摄一段名为 "lightarea2" 的光斑位置短视频，并与 "lightarea1" 进行比对，以确认光斑位置未发生改变。若发现明显的位置偏移，则应舍弃该组数据。
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结果
图1：实验装置。（A）基于光斑的幼虫快速趋光性实验装置的示意图。蓝线表示用于视觉刺激的可见光光路，红线表示红外光光路。箭头指示光的传播方向。850 nm带通滤光片允许红外光通过，但阻隔可见光。（B）光斑实验装置的实际图像。需注意的是，该图像在有利于可视化的光照条件下拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 850 nm ± 3 nm 红外光发射 LED | Thorlabs, USA | PM100A | 兼容传感器：光电二极管和热电型传感器<br/> 光学功率范围a：100 pW 至 200 W<br/> 可用传感器波长范围a：185 nm - 25 μm 显示刷新率：20 Hz<br/> 带宽：DC - 100 kHz<br/> 光电二极管传感器范围b：50 nA - 5 mA<br/> 热电堆传感器范围b：1 mV - 1 V |
| 交流转直流转换器 | Thorlabs, USA | S120VC | 孔径尺寸：Ø9.5 mm<br/> 波长范围：200 - 1100 nm<br/> 功率范围：50 nW - 50 mW<br/> 探测器类型：硅光电二极管（紫外扩展型）<br/> 线性度：±0.5%<br/> 测量不确定度c：±3%（440 - 980 nm），±5%（280 - 439 nm），±7%（200 - 279 nm，981 - 1100 nm） |
| 带通滤光片 | Thorlabs, USA | DC2100 | LED 电流范围：0 - 2 A<br/> LED 电流分辨率：1 mA<br/> LED 电流准确度：±20 mA<br/> LED 正向电压：24 V<br/> 调制频率范围：0 - 100 kHz 正弦波<br/> 调制方式：任意 |
| 准直蓝光 LED | ELP, 中国 | USBFHD01M | 最大分辨率：1920×1080<br/> F6.0 mm<br/> 传感器：1/2.7" CMOS OV2710 |
| 紧凑型功率计主机 | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | 尺寸：89.1 mm × 63.3 mm × 34.4 mm<br/> 重量：190 g<br/> 探测器：Sony ILX511B（2048 元素线性硅 CCD 阵列）<br/> 波长范围：200 - 850 nm<br/> 积分时间：1 ms – 65 秒（典型值为 20 秒）<br/> 动态范围：8.5 × 10^7（系统）；单次采集为 1300:1<br/> 信噪比：250:1（满信号）<br/> 暗噪声：50 RMS 计数<br/> 光栅：2（250 – 800 nm）<br/> 狭缝：SLIT-50<br/> 探测器收集透镜：L2<br/> 消杂级滤光片：OFLV-200-850<br/> 光学分辨率：约 2.0 nm FWHM<br/> 杂散光：<0.05%（600 nm 处）；<0.10%（435 nm 处）<br/> 光纤连接器：SMA 905 转 0.22 数值孔径单股光纤 |
| 高功率 LED 驱动器 | Minhongshi, 中国 | MHS-48XY | 工作电压：DC12V<br/> 中心波长：850 nm |
| 高分辨率网络摄像头 | Thorlabs, USA | MWWHL4 | 颜色：暖白<br/> 相关色温：3000 K<br/> 典型 LED 功率测试电流：1000 mA<br/> 最大电流（连续）：1000 mA<br/> 带宽（FWHM）：不适用<br/> 电功率：3000 mW<br/> 视角（全角）：120°<br/> 发光体尺寸：1 mm × 1 mm<br/> 典型寿命：>50 000 小时<br/> 工作温度（非冷凝）：0 至 40 °C<br/> 存储温度：-40 至 70 °C<br/> 风险等级a：RG1 – 低风险等级 |
| 暖白 LED | Mega-9, 中国 | BP850/22K | Ø25.4(+0 ~ -0.1) mm<br/> 带宽：22±3 nm<br/> 峰值透射率：80%<br/> 中心波长：850 nm±3 nm |
| 光谱仪 | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap 是一款具备高级预览和录制功能的静态图像与视频采集应用程序。<br/>该软件为桌面应用程序，适用于运行 Windows 7 SP1 或更高版本操作系统的计算机。<br/>支持大多数 Video-for-Windows 和 DirectShow 兼容设备，无论是廉价的网络摄像头还是高级视频采集卡。 |
| 标准光电二极管功率传感器 | Super Dragon, 中国 | YGY-122000 | 输入：AC 100 - 240 V ~ 50/60 Hz 0.8 A<br/> 输出：DC 12 V 2 A |
| 热功率传感器 | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | 颜色：蓝色<br/> 标称波长a：470 nm<br/> 带宽（FWHM）：25 nm<br/> 最大电流（连续）：1000 mA<br/> 正向电压：3.2 V<br/> 电功率（最大）：3200 mW<br/> 发光体尺寸：1 mm × 1 mm<br/> 典型寿命：100 000 小时<br/> 工作温度（非冷凝）：0 至 40 °C<br/> 存储温度：-40 至 70 °C<br/> 风险等级b：RG2 – 中等风险等级 |
| 热功率传感器 | Thorlabs, USA | S401C | 波长范围：190 nm - 20 μm<br/> 光功率范围：10 μW - 1 W（3 Wb）<br/> 输入孔径尺寸：Ø10 mm<br/> 有效探测器面积：10 mm × 10 mm<br/> 最大光功率密度：500 W/cm²（平均）<br/> 线性度：±0.5% |
