幼虫环腺解剖：从Drosophila中分离发育性内分泌器官

摘要

来源：Imura, E. 等。利用免疫染色技术在果蝇 Drosophila melanogaster 中可视化类固醇生成器官及其相互作用器官的实验方案。J. Vis. Exp. （2017）。

本视频介绍了Drosophila环腺，这是一种重要的内分泌结构，参与蜕皮类固醇及其他激素的生物合成与分泌。本实验方案展示了环腺的解剖、固定及免疫染色操作过程。

方案

本方案节选自 Imura 等人，《利用免疫染色技术在果蝇 Drosophila melanogaster 中可视化类固醇生成器官及其相互作用器官的实验方案》，《可视化实验杂志》（J. Vis. Exp.，2017年）。

注意： 整体实验方案流程如图1所示。

1. 幼虫环腺（RG）的解剖

注意：在属于环裂亚目双翅目的D. melanogaster中，前胸腺（PG）位于一种称为环腺（RG，图2D）的复合内分泌器官内。由于无法通过手术将PG与其他类型的细胞完全分离（后文将讨论），一个可行的目标是通过解剖分离出完整且未受损的RG。

1. 准备处于适当发育阶段的幼虫
   注意： 为了同步发育阶段 D. melanogaster 幼虫，必须在很窄的时间窗口内收集卵，并在适当的时间收集幼虫。
   1. 在25 °C条件下，于葡萄汁琼脂平板上收集卵2小时。
   2. 收集新孵化的1^st 在解剖显微镜下用镊子挑取龄期幼虫，并转移至含有压碎的标准酵母/玉米粉果蝇食物的小瓶中。
      注意： 幼虫的年龄用以下方式表示 "卵孵化后小时（hAEL）", "孵化后小时（hAH）"，或 "L3蜕皮后小时数（hAL3E）".
   3. 在适当的时间点，使用一次性塑料接种环收集处于特定阶段的幼虫，以避免造成不必要的损伤。为尽量减少3个^rd 龄幼虫，收集第2龄幼虫^nd 70 hAEL（48 hAH）的龄期幼虫，使其在2小时时间隔内蜕皮。随后，收集3^rd L3蜕皮后2小时内收集的龄期幼虫；该操作可获得0-2小时龄L3蜕皮后（0-2 hAL3E）幼虫。
   4. 将已分级的幼虫转移至盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
   5. 用PBS冲洗幼虫，以去除体表残留的食物。
2. 在解剖显微镜下对幼虫进行粗分离
   1. 用镊子夹住幼虫的口钩，在幼虫体长前三分之一处用显微剪刀切断虫体。
   2. 用一对镊子夹住幼虫前部切端，用另一对镊子轻轻将头部顶端向体内推入，使幼虫体壁外翻。
      注意： 此步骤在进行1的解剖时可以省略^st 龄幼虫
   3. 用额外的幼虫重复步骤 1.2.1–1.2.2，持续 5–10 分钟。
      注意： 幼虫数量应等于或少于20只，以节省解剖时间。
3. 组织的免疫组织化学固定与染色
   1. 将幼虫身体的前三分之一部分（步骤 1.2.2）放入盛有 500 µL 固定液（含 4% 多聚甲醛的 PBS）的 1.5 mL 微管中。每次固定样本数量应少于 20 个，否则附着在样本上的 PBS 可能导致固定液被过度稀释而影响效果。进行肌片解剖时，先移除一滴 PBS，再加入一滴固定液。
      注意： 固定液可选用3.7%甲醛或4%多聚甲醛。
   2. 将解剖后的组织在固定液中于室温（RT）孵育30分钟，或 alternatively 在4 °C孵育2小时。
   3. 将固定液替换为500 µL PBS，迅速冲洗样品3次。在室温下，将样品置于摇床上，用500 µL含0.3%辛基酚聚氧乙烯醚的PBS缓冲液（0.3% PBT）振荡洗涤15分钟。进行肌片解剖时，移除昆虫针，并将样品转移至1.5 mL微量离心管中。
      注意： 为增强抗体在组织中的渗透性，将样品置于摇床上，室温下用500 µL 2.0% PBT处理1–2小时。
   4. 用500 µL封闭液（含2%牛血清白蛋白的PBT）替换PBT。将样品在室温下于摇床上孵育1.5小时。
   5. 用 50 µL 一抗溶液替换封闭液， 即 用封闭液稀释的抗体。
   6. 4 °C 条件下在摇床上孵育样品过夜。
   7. 用500 µL 0.3% PBT替换一抗溶液，迅速冲洗样本5次。在摇床上用500 µL 0.3% PBT于室温下洗涤样本3次，每次15分钟。
   8. 用50 µL二抗溶液（将荧光标记抗体用封闭液稀释）替换0.3% PBT。若需进行细胞核染色，向50 µL溶液中加入0.5 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.1 mg/mL储存液）。将样品置于摇床上，在室温孵育2小时，或 alternatively 在4 °C过夜孵育。
      注意： 将样品避光保存。
   9. 用500 µL 0.3% PBT替换抗体溶液，漂洗5次。在室温下，用500 µL 0.3% PBT洗涤样品3次，每次15分钟。
4. 精细解剖包含PG的脑-RG复合体并进行固定
   1. 使用一次性移液管将免疫染色的样品转移至装有0.3% PBT的培养皿中。
      注意： 为避免解剖和封片过程中产生不便的气泡，可将0.3% PBT替换为PBS。
   2. 在解剖显微镜下，用一对镊子夹住幼虫的表皮或口钩。使用连接在1 mL注射器上的27 G针头作为 "刀"，剪断食道前端和眼盘，以从体壁角质层中移除脑-RG-眼盘复合体。
   3. 用镊子将食道和肠道与脑-围咽环-眼盘复合体分离。由于食道穿过腹神经索上方的脑部，需将肠道向后方拉出。
      注意： 用针刀切断脑、眼盘和腿盘之间的连接，以去除样本中多余的成虫盘。
   4. 重复步骤 1.4.1–1.4.4 处理其他样品。
      注意： 为防止组织碎片粘附在样品上，将每个完成的样品转移至盛有0.3% PBT或PBS的不同洁净培养皿中。
   5. 用移液器将样品转移至洁净的玻璃载玻片中央。
      注意： 2 对于^nd 或 3^rd 一龄幼虫阶段，应使用剃刀片截断微量移液器吸头的末端。
   6. 在解剖显微镜下，使用镊子将各个样品背侧朝上摆放整齐。
      注意： RG 位于大脑的背侧（图2A这种对齐方式有助于在成像过程中精确定位各个样品。
   7. 倾斜载玻片，尽可能擦去多余的 PBT。在载玻片一侧滴加一滴封片剂。用镊子夹住盖玻片，从液滴的另一侧边缘缓慢将盖玻片覆盖在样品上。
      注意： 该步骤可防止样品移出盖玻片范围。
   8. 将样品在 4 °C 下保存。避光保存样品。

结果

图1：实验方案总体流程图。 根据实验目的不同，幼虫和成年雌性果蝇分别采用两种不同的解剖方法。封片方法也根据样本状态进行相应设计。固定、染色和成像技术则基本适用于所有样本。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>卵的收集</strong>
组织培养皿（55 mm）	AS ONE	1-8549-02	葡萄汁琼脂平板
收集杯	光科学
酵母膏	东方干酵母，东京
100% 葡萄汁	Welch Food Inc.
饲养幼虫
小瓶（12 ml，40）&times;23.5 mm，PS	SARSTEDT	58.487
一次性接种环	AS ONE	6-488-01
标准果蝇食物			配方位于布卢明顿果蝇资源中心网站。
<强>解剖</strong>
解剖显微镜	卡尔·蔡司	Stemi 2000-C
解剖显微镜	Leica	S8 AP0
组织培养皿（35 × 10 mm，未处理）	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		在培养皿中包埋硅
Terumo 针头（27G，0.40 × 19 mm）	TERUMO	NN-2719S	A "刀" 切割组织
镊子，Inox，#5	杜蒙，瑞士
昆虫针（直径0.18 mm）	志贺品牌		用于去皮解剖
显微剪刀	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
<强>固定</strong>
超纯水	默克密理博
磷酸盐缓冲液（PBS）
甲醛	那可利得生技	16222-65
多聚甲醛	那可利得生	02890-45
Triton-X100	那卡来特思克	35501-15
微型离心管（1.5 ml）	INA OPTIKA	CF-0150
<强>孵育</strong>
As one Swist Mixer TM-300（摇床）	作为一个	TM-300	摇床
牛血清白蛋白	SIGMA	9048-46-8
<强>一抗</strong>
抗Sro抗体（豚鼠），1:1000
抗GFP（兔），1:1000	分子探针	A6455	Shimada-Niwa 和 Niwa，2014
抗GFP（小鼠单克隆抗体，GF200），1:100	Nakarai tesque	04363-66
抗5HT（兔），1:500	SIGMA	S5545
抗Hts 1B1（小鼠）	发育研究杂交瘤库 (DSHB)	1B1
抗DE-钙黏蛋白（大鼠），1:20	DSHB	DCAD2
抗nc82（小鼠），1:50	DSHB	nc82
<强>二抗</strong>
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记	Life Technologies	A-11008
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记	Life Technologies	A-11001
山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 546标记	Life Technologies	A-11081
山羊抗豚鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 荧光染料标记的鬼笔环肽	生命技术公司	A-22283
<强>封片剂</strong>
显微载玻片	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
方形显微镜盖玻片	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave 试剂（封片剂）	Calbiochem	345789
移液管 1 ml（一次性滴管）	WATSON	5660-222-1S
<强>果蝇品系</strong>
w；GMR45C06-GAL4			来自布卢明顿果蝇资源库。（#46260）
UAS&ndash;GFP；UAS&ndash;mCD8::GFP			东京大学伊藤克（K. Ito）惠赠
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w；UAS-mCD8::GFP；TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) 和 Alekseyenko, O. V, Lee, C. &amp; Kravitz, E. A. (2010)
w；UAS-mCD8::GFP			来自布卢明顿果蝇资源中心。（#32188）
yw;; nSyb-GAL4			来自布卢明顿果蝇资源中心。（#51941）