局部热探针检测法：一种评估对高温伤害性感受的方法 果蝇 幼虫

摘要

来源：Chattopadhyay, A.，等 局部与整体评估热痛觉的方法 果蝇 幼虫. 视频实验杂志 (2012).

Drosophila 幼虫具有特化的感觉神经元——伤害性感受器——当受到潜在有害的热刺激时，这些神经元会引发动物产生回避性行为，即所谓的"伤害防御性"行为。本视频介绍了一种通过记录热探针局部作用于体壁时幼虫行为反应来评估热伤害性感受的方法。因此，该方法被称为局部热探针检测法。

方案

本方案节选自 Chattopadhyay 等局部与整体评估热痛觉的方法 果蝇 幼虫， J. Vis. Exp. (2012).

1. 局部热探针检测法

我们使用 Pro-Dev Engineering 公司（见材料表）定制制造的热探针，向单个幼虫体节施加有害的热刺激。尽管该探针具有优化的设计特性（约 0.07 mm 的细小金属尖端）² 区域以及能够精确维持 23 °C 至 65 °C 设定点温度的能力）原则上，任何具有小型尖端且可在长达 20 秒的时间内加热至设定温度的工具均应足够适用。该探针尖端用于刺激早期 3^rd 四龄幼虫腹部第四节背中线精确位置（参见 图1）。作为对这种热刺激的反应，幼虫通常会表现出逃避性的回撤行为，即侧向滚动超过360度。该行为不同于它们对无伤害性室温金属探针轻触刺激的反应，后者通常仅表现为运动活动的短暂暂停。

热探针实验方案：

1. 将热探针的预设温度调至所需设定值。
2. 使用画笔或镊子轻轻将单个幼虫转移至一个平坦的平台（我们通常使用从文件夹上剪下的小块乙烯基材料）上，以便后续进行刺激。在与热探针接触前，幼虫应被一层薄水膜覆盖。覆盖幼虫的水膜应尽可能少，但需完全覆盖幼虫，同时确保幼虫接触乙烯基时不会干燥。
3. 将探针尖端轻轻压在幼虫A4体节处，探针与幼虫表面呈约45°角，施加轻微压力（见图1）。压力应使幼虫表面产生轻微凹陷，通常足以阻止其运动。若幼虫继续移动，可略微增加压力，通常即可停止。对于超出视野范围移动或无法在整个刺激过程中保持探针稳定接触直至出现反应或达到20秒截止时间的幼虫，不应记录其数据。
4. 持续刺激幼虫，直至其表现出逃避反应或达到20秒截止时间，以先发生者为准。有反应的幼虫通常首先表现出抬头和翘尾的初步行为，随后通常会进行至少360度的滚动以完成逃避行为。仅将完整的360度滚动记为伤害性防御行为（初步的抬头或翘尾不计入）。
5. 一旦逃避行为开始，立即撤去探针接触，并记录逃避反应的潜伏期或反应时间。若在20秒内未观察到逃避行为，则该幼虫记为无反应者。有反应者可进一步分为两类：若逃避行为在5秒内出现，则该幼虫为快速反应者；若逃避行为出现在5至20秒之间，则该幼虫为慢速反应者（参见Babcock et al., Curr. Biol. (2009) 中的 图1）。

结果

图1：局部热探针实验的实验装置。 热探针由温控单元控制，用于设定并维持探针的温度。探针垂直于前后轴放置，并以与水平方向成45°的角度刺激幼虫。探针接触点特异性地位于腹部第A4节段，如图所示。操作者需以轻微压力保持接触，直至达到20秒的时间上限，或直至翻滚行为开始。若温度被感知为有害，幼虫将表现出回避性撤退行为，特征为至少完成一次360°翻滚。翻滚次数可为单次或多次（见图2B）。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
热探针	Pro-Dev Engineering	按需定制	可根据要求提供联系方式
Leica DFC290 12v/400mA 彩色相机	Leica Microsystems	12730080	任何等效相机均可使用。
Leica MZ6 体视显微镜	Leica Microsystems	MZ6 变焦镜体（光学支架）的部件号为 10445614
Schott Ace Modulamp 照明单元	Schott AG	A20500
Schott 双蛇形管 23 英寸光纤导光管	Schott AG	Schott A08575
温度控制单元	TSCI corp.	定制设备	可根据要求提供详细信息
Zeiss Stemi 2000 显微镜	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	任何等效显微镜均可使用。
镊子	Fine Science Tools	FS-1670
画笔	Blick Art Materials	06762-1002
35 × 10 mm 聚苯乙烯培养皿	Falcon BD	351008	我们未测试过其他替代培养皿。
乙烯基片材	Office Depot	480009