温度梯度实验：一种检测温度偏好的方法 果蝇 幼虫

摘要

来源：Liu, J. 等。利用温度梯度实验测定果蝇幼虫的温度偏好。J. Vis. Exp. (2018)。

Drosophila 果蝇能够区分微小的温度变化，因此可以选择具有有利热条件的环境。本视频介绍了一种行为检测方法，用于测试 Drosophila 幼虫在直线温度梯度上的温度偏好。

方案

本方案节选自 Liu 等 一种用于测定生物体温度偏好的温度梯度实验方法 果蝇 幼虫， 视频实验杂志 (2018).

1. 温度梯度设置

1. 制备单向梯度
   1. 为在实验过程中创建湿润的环境，将连接至两个水浴的两块铝块放置在湿润的纸巾上，两者相距 10 cm（图 1A）。
   2. 在开始实验前约 2 小时开启两个水浴，以确保铝块温度达到平衡。
      注意：建议先进行一次模拟实验，以确定每个水浴所需的温度，从而实现理想的线性温度梯度。一些典型的水浴温度设置组合列于表 1中。但需注意，铝块表面温度会受到环境温度的影响。此外，由于管道中存在冷却效应，管道长度也会影响温度。本实验装置中管道长度为 1.5 m。
   3. 将 100 mL 的 1% 琼脂糖置于 500 mL 圆口广口瓶中，使用高功率微波加热，然后在水平实验台上每块实验平板倾注 25 mL。准备两块实验平板，以便可同时放置于铝块上（图 1A）。
   4. 待琼脂糖凝固后（10–20 分钟），用标准厨房海绵或密胺海绵轻轻擦拭每块琼脂糖表面，使其略显粗糙，以便在喷洒水时形成一层光滑且均匀的薄水膜，避免形成水滴。
   5. 在实验开始前，将平板完全浸没于盛有蒸馏水的容器中，以防止平板干燥。
2. 制备双向梯度（可选）
   1. 为在实验过程中创建湿润的环境，将三块铝块放置在湿润的纸巾上，每块之间相距 8 cm（图 1B）。
   2. 在开始实验前约 2 小时开启两个水浴，以确保铝块温度达到平衡。
      注意：建议先进行一次模拟实验，以确定双向梯度所需的各水浴温度。一些典型的水浴温度设置组合列于表 2中。但需注意，铝块表面温度会受到环境温度的影响。此外，由于管道中存在冷却效应，管道长度也会影响温度。本实验装置中管道长度为 1.5 m。
   3. 为防止琼脂糖溢出平板，使用标签胶带包裹铝板边缘，形成一个高 10 mm 的围挡（图 1B）。
   4. 将 200 mL 的 1% 琼脂糖置于 500 mL 圆口广口瓶中，使用高功率微波加热，然后在一块实验平板上倾注 120 mL。
   5. 待琼脂糖完全凝固后（约 30 分钟），用标准厨房海绵或密胺海绵轻轻擦拭每块琼脂糖表面，使其略显粗糙，以便在喷洒水时形成一层光滑且均匀的薄水膜，避免形成水滴。
   6. 在实验开始前，将实验平板完全浸没于盛有蒸馏水的容器中，以防止其干燥。
3. 设置单向梯度
   1. 在梯度实验装置旁的实验台上准备好试剂和物品（参见材料表）。
   2. 为促进高效的热传导，在铝块与实验平板之间的界面处喷洒水，以填充任何缝隙。
   3. 佩戴手套将实验平板从盛水容器中取出。若水渗入琼脂糖凝胶与平板之间并导致表面出现鼓包，需使用 P1000 微量移液器将水吸除。
   4. 将实验平板放置于铝块上，确保平板两侧距边缘 2 cm 处的标记线与铝块边缘完全对齐（图 1A,C）。
   5. 向平板表面喷洒水（覆盖琼脂糖表面的一层薄水膜即可），以防止琼脂糖凝胶干燥。确保水膜连续且无水滴，因为幼虫可能被困在水滴中。
   6. 用纸板箱覆盖梯度系统，以减少水分蒸发并帮助稳定凝胶表面温度。静置 5–10 分钟，使温度达到平衡。
   7. 在平板上 12 个点检测表面温度（图 1C）。在每个区域取两个测量值，以判断区域内是否存在温度差异。确保两个测量点的温度均在目标温度的 ± 0.2 °C 范围内。
      注意：区域内的温度差异通常是因为两个测量点到铝块边缘的精确距离不一致所致。调整平板在铝块上的位置，确保平板两侧距边缘 2 cm 处的标记线与铝块边缘完全对齐。
   8. 若实测温度梯度偏离目标梯度，可升高或降低水浴温度设定值，并在水浴温度稳定后重新检测表面温度。
   9. 在开始实验前，用纸板箱覆盖梯度系统。
4. 设置双向梯度（可选）
   1. 在梯度实验装置旁的实验台上准备好试剂和物品（参见材料表）。
   2. 向三块铝块表面喷洒水，以填充表面之间的缝隙，促进铝块向实验平板高效传热。
   3. 小心地将实验平板从盛水容器中取出，并放置于铝块上。若水渗入琼脂糖凝胶与平板之间并可能导致表面鼓包，需使用 P1000 微量移液器将水吸除。
   4. 将实验平板放置于铝块上，确保平板两侧最靠近边缘的第一区和最后一区的中线分别与两侧铝块的边缘完全对齐（图 1B,D）。
   5. 向平板表面喷洒水（覆盖琼脂糖表面的一层薄水膜即可），以防止琼脂糖凝胶干燥。确保水膜连续且无水滴，因为幼虫可能被困在水滴中。
   6. 用纸板箱覆盖梯度系统，以减少水分蒸发并帮助稳定凝胶表面温度。静置 5–10 分钟，使温度达到平衡。
   7. 在 10 个区域的每个区域中线位置的两个点检测表面温度（图 1D）。在每个区域取两个测量值，以判断区域内是否存在温度差异。确保两个测量点的温度均在目标温度的 ± 0.2 °C 范围内。
      注意：区域内的温度差异通常是因为两个测量点到铝块边缘的精确距离不一致所致。调整平板在铝块上的位置，确保平板两侧最靠近边缘的第一区和最后一区的中线分别与两侧铝块的边缘完全对齐。
   8. 若实测温度梯度偏离目标梯度，可调整水浴温度设定值，并在水浴温度稳定后重新检测表面温度。
   9. 在实验开始前，用纸板箱覆盖铝块。

2. 检测与计算

1. 在将幼虫转移至培养皿前，立即移除纸板箱并检查凝胶表面温度。尽量缩短纸板箱打开的时间，以避免干扰温度平衡。若表面干燥，可喷洒少量水于表面。
2. 在单向梯度实验中（释放区；图1C），将150 ± 50条幼虫分布在每个培养皿中心附近（6个区域中的第3与第4区之间）。
   注意：对于双向梯度实验，将200–400条幼虫分别分布在每半侧的中央区域（图1D）。
3. 在每个检测培养皿上放置一个微孔板盖，防止幼虫爬出。用纸板箱覆盖整个装置，以避免光照影响幼虫在琼脂糖凝胶上的选择行为。
   注意：对于双向梯度实验，通常无需加盖微孔板盖，因为培养皿较大，且幼虫的偏好温度位于中央区域，因此极少幼虫会聚集在边缘并有机会爬出。
4. 根据幼虫的龄期（表3），单向梯度实验进行10–30分钟，双向梯度实验进行15–35分钟。
5. 移除纸板箱和微孔板盖。使用数码相机从上方拍摄培养皿照片。每个检测培养皿拍摄两张照片，以便研究者选择对比度和亮度更佳的一张用于分析。
6. 通过抽吸方式清除检测培养皿上及周围所有幼虫。
7. 用蒸馏水彻底清洗检测培养皿、试管和细胞筛。当日制备的检测培养皿可重复使用，除非琼脂糖表面受损。
8. 计算各区域内幼虫的百分比分布。
   1. 使用任意可对图像添加标记的软件打开检测结果的照片图像。根据培养皿上的刻度标记，每隔2 cm绘制一条垂直线，以标示检测区域。
   2. 统计每个区域内的幼虫数量并记录。不要计入距离任一器壁0.5 cm范围内的幼虫，因为器壁附近凝胶较厚，表面温度在此区域呈非线性分布。
   3. 对于单向梯度实验，按以下公式计算每个区域的百分比分布：
      （某一2 cm区域内的幼虫数）/（6个区域中幼虫总数）× 100。
   4. 对于双向梯度实验，按以下公式计算每个区域的百分比分布：
      （某一2 cm区域内的幼虫数）/（梯度每侧5个区域中幼虫总数）× 100。

结果

图1：单向与双向梯度实验装置示意图。 (A) 单向梯度装置，包含两个置于铝块上的铝制实验板。铝块的温度通过两个水浴循环控温的水流进行调节。(B) 用于构建双向梯度的三个铝块、水浴装置及一块铝板（250 × 220 mm）的排列方式。左右两侧铝块连接至同一水浴，中间铝块连接至另一水浴。铝制实验板用胶带包裹形成10 mm高的围挡，以容纳1%琼脂糖。(C) 用于检测温度的位置（以圆点表示）以及幼虫释放位置。在开始实验前，需在每个区域内的两个位置测量温度，以确认已建立所需的线性温度梯度。幼虫释放于中线附近的指定区域内，并在各个2 cm宽的区域中计数。(D) 双向梯度中用于检测...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
梯度实验装置
PolyScience 9106，制冷/加热 6L 循环水浴	Thomas Scientific	9106	该型号已停产。更新的替代型号包括：适用于 120 V、60 Hz 的 1186R00 和 1197U04，或适用于 240 V、50 Hz 的 1184L08 和 1197U04。
铝制实验板（用于单向梯度）			外部尺寸：14 × 10.1 × 0.9 cm，内部尺寸：12.9 × 8.7 × 0.8 cm，黑色阳极氧化处理。
铝板（用于双向梯度）			25 × 22 × 0.2 cm，黑色阳极氧化处理。
铝块			外部尺寸：25.5 × 5 × 1.4 cm，内部通道参数见图 1D。
铝块与管路连接器	McMaster-Carr	91355K82
Tygon 卫生级硅胶管	Tygon	57296	内径 1/4"，外径 3/8"，壁厚 1/16"
名称	公司	货号	备注
实验所需物品与试剂
研钵	USA Scientific	17361	适用于 1.5 mL 微量离心管的研钵
温度计	Fluke	51II
热电偶	Fluke	K 型
通用微孔板盖	Corning	6980A77
35 mm 培养皿	Corning	9380D40
标签胶带（用于双向梯度）	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand 标签胶带，2 英寸 × 14 码
琼脂糖	Invitrogen	16500500	配制 1% 溶液
蔗糖	Sigma	S0389-5KG	实验开始前现配 18% 溶液
画笔	Fisher Scientific	11860
50 mL 离心管	Denville	C1062-P
药匙	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL 圆口广口瓶	Pyrex	1395-500
细胞筛网（300 mm 孔径）	PluriSelect	43-50300	幼虫清洗可选用品
纸板盒（离心管架）	Genesee Scientific	FS32-124