Drosophila 活动监测仪（DAM）：一种测量果蝇运动活性的方法

摘要

来源：Chiu, J. C. 等 检测运动活性以研究昼夜节律和睡眠参数 果蝇. 视频实验杂志 (2010).

本视频介绍了用于追踪果蝇活动的Drosophila活动监测（DAM）系统。研究人员利用DAM系统采集的活动数据来研究果蝇的昼夜节律。本视频演示的实验方案展示了如何将果蝇装入设备，以及如何记录用于昼夜节律实验的活动数据。

方案

本方案节选自 Chiu et al.，《利用运动活性检测研究果蝇的昼夜节律与睡眠参数》，《视觉实验杂志》（J. Vis. Exp.，2010年）。

1. 将果蝇装入活动管并接入运动活动监测系统

1. 在将果蝇装入活动管之前，先打开用于放置活动监测仪的培养箱。使用培养箱的温控装置调节温度，并根据实验设计要求，通过DAM系统光照控制器或培养箱自带的光照控制系统设定光照/黑暗周期。装入果蝇所需的时间应足以使培养箱内温度达到稳定。
2. 使用二氧化碳麻醉果蝇。
3. 用细毛笔轻轻将一只果蝇转移至一根活动管中。
4. 用精细镊子夹住一段长约半英寸的纱线中段，将其插入活动管的非食物端，以封堵开口，防止果蝇在实验过程中逃逸，同时允许空气流通。或者，也可使用带小孔的塑料盖（Trikinetics, Inc.）封闭管口。
5. 确保在果蝇苏醒前将活动管平放，否则果蝇可能被困在食物中。
6. 将活动管插入活动监测仪中。对于较新型、更紧凑的Trikinetics监测仪（Trikinetics DAM2 和 DAM2-7），需使用橡皮圈固定活动管，以确保红外光束穿过玻璃活动管的中心位置。
7. 将活动监测仪放入培养箱，并通过电话线连接至数据采集系统。使用DAM系统采集软件检查，确保所有监测仪正确连接，并且每个监测仪的数据均被正常采集。监测仪会发射一束红外光穿过每根玻璃活动管的中心位置，果蝇的运动活动以原始二进制数据记录，每当红外光束被阻断时记录为"1"，未阻断时记录为“0”。

2. 用于记录昼夜节律周期性和振幅数据的实验设计

1. 果蝇通过暴露于设定的光照/黑暗（LD）周期和温度条件下 2 至 5 个完整昼夜进行同步化和节律诱导。最常用的诱导条件是在 25 °C 下采用 12 小时光照/12 小时黑暗（12:12 LD）的光周期。这一普遍接受的标准条件主要基于以下考虑： 黑腹果蝇 源自赤道非洲地区。在研究昼夜节律时，需熟悉一些特定术语。与本实验方案相关的是，光照培养箱中光照开启的时间被定义为外界授时因子时间0（zeitgeber time 0，ZT0），其他所有时间均相对于该时间点（例如，在12小时光照:12小时黑暗的光周期条件下，ZT12表示光照关闭的时间）。在标准的12:12光暗周期条件下，野生型 黑腹果蝇 通常表现出两次活动高峰，其中一次集中在ZT0附近，称为 "早晨" 一个峰值以及另一个在ZT12左右的峰值 "傍晚" 峰图1A）。早晨和傍晚的行为高峰受内在生物钟调控，但同时也存在其他因素影响 "惊吓" 对光暗转换产生短暂的活动激增反应。至少需要两天的同步化时间，这可用于某些耗时较长的大规模筛选实验，尤其是旨在测量恒定黑暗条件下自由运行周期的研究（见下文步骤2）。然而，若研究目标是分析果蝇在每日光暗循环中的活动模式，则建议将果蝇在光暗周期（LD）条件下维持4至5天，以获取更充分的数据。本质上，在最终数据分析中增加果蝇数量或光暗周期天数（例如，合并最后两天的运动活动数据），将能生成更可靠的昼夜活动谱型和测量结果（如早晨或傍晚活动峰的时间）。此外，每日活动分布会随昼夜长度（光周期）和温度的变化而改变。改变光周期或温度的一个主要原因是研究日常活动模式如何实现季节性适应（例如，Chen）。 等人，冷泉港定量生物学研讨会。 (2007)). 果蝇 也可以被每日温度周期所同步（例如 Glaser 和 Stanewsky， 当代生物学 （2005）；Sehadova 等, 神经元 （2009））。仅2-3°C的温度变化周期就足以同步活动节律。
2. 在限定周期结束后，在恒定黑暗和恒定温度条件下测量果蝇的自由运行昼夜活动节律（见上文步骤1）。可在明暗循环（LD）最后一天的暗期任意时间更改光照周期设置，使实验的下一天成为恒定黑暗（DD）的第一天。连续收集7天的DD数据足以计算果蝇的昼夜节律周期及节律振幅（例如节律的功率或强度）。通常，每种基因型至少需要16只果蝇的样本量，才能获得可靠的自由运行周期。即使研究者仅关注测量昼夜活动，仍建议在DD条件下测定果蝇的自由运行周期，因为内源性周期的改变会影响LD条件下的日常活动分布。例如，具有较长内源性周期的果蝇在LD条件下通常表现出晚间活动峰的延迟（例如参见 图2).
3. 实验结束后，使用 DAM 系统软件采集的原始二进制数据将被下载至便携式数据存储设备（如 U 盘）。
4. 原始二进制数据使用 DAM Filescan102X（Trikinetics, Inc.）进行处理，在分析昼夜节律参数时，汇总为15分钟或30分钟的时间段，在分析睡眠/静息参数时，则汇总为1至5分钟的时间段。目前，连续五分钟的不活动是果蝇中睡眠/静息的标准定义 黑腹果蝇 （亨德里克斯 等，Neuron (2000)；Ho 和 Sehgal， 酶学方法， (2005)).
5. 分析DAM系统收集的数据有多种方法，但我们仅介绍本实验室常规使用的方法。使用Microsoft Excel将不同样本组分配基因型。使用FaasX软件（M. Boudinot和F. Rouyer，法国国家科学研究中心，Gif-sur-Yvette Cedex）或Insomniac（基于Matlab的程序；Leslie Ashmore，美国宾夕法尼亚大学）分别分析昼夜节律参数（如周期和功率）或睡眠/休息参数（如睡眠百分比、平均静息持续时间）。

结果

图1：使用FaasX生成的活动节律图，显示具有节律的野生型果蝇（携带 per+ 转基因的 w per⁰ 果蝇）(A 和 B) 与无节律的 w per⁰ 突变体 (C 和 D) 的每日运动活动节律。 雄性果蝇在25 °C下培养，先在12:12明暗循环（光：暗）条件下同步4天，随后转入恒定黑暗（DD）中7天。对每种果蝇品系，分别测量单个果蝇（n>32）每15分钟时间段内的运动活动水平，然后取平均值以获得代表该品系的群体活动模式。A和C显示的是明暗循环条件下第2至第3天（LD 2-3）活动数据的平均值，而B和D显示的是恒定黑暗条件下第2至第3天（DD 2-3）活动数据的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇活动监测仪（DAM）	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 或 DAM5	DAM2 监测仪更紧凑，可在单个培养箱中容纳更多设备
电源接口单元（用于 DAM 系统）	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	包含 PS9-1 交流电源适配器
光照控制器	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
派热克斯玻璃管	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5、PGT7 和 PGT10
塑料活动管帽	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	可使用纱线代替塑料管帽。
DAM 系统数据采集软件	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		提供适用于 Mac 和 PC 的版本
FaasX 软件	法国国家科学研究中心		仅适用于 Mac
Insomniac 2.0 软件	匹兹堡大学医学院		在 Matlab 上运行，可在 PC 和 Macintosh 上使用。
具备温度和昼夜控制功能的环境培养箱，例如 Percival 培养箱	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	内部空间尺寸：宽度：65 cm；高度：86 cm；深度：55 cm
具备温度和昼夜控制功能的环境培养箱，例如 DigiTherm 加热/制冷培养箱，带昼夜定时照明和温度控制	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	内部空间尺寸：宽度：36 m；高度：56 m；深度：28 cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V（应急电源备份装置）	APC	SU2200NET	输出功率容量：1600 瓦
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
细菌琼脂	BD Biosciences	214010
TissuePrep 石蜡颗粒	Fisher Scientific	T565	熔点 56 °C-57 °C
金属浴加热器	VWR international	12621-014