德罗索菲拉 光遗传学：操纵神经元电路的方法

摘要

资料来源：德弗里斯，S.E.，克兰迪宁，T. 光遗传刺激逃生行为在 德索菲拉梅拉诺加斯特。 J. 维斯 (2013).

光遗传学使光能够操纵基因工程的神经元，以表达特定的蛋白-光敏蛋白，其光激活触发神经元状态的变化。在这里，我们描述了一种光遗传方法在 德罗索菲拉 使用蛋白辛通道磷脂2。示例协议具有光遗传学检测设置，以研究苍蝇逃逸行为背后的神经元电路。

方案

本协议摘自德弗里斯和克兰迪宁，光遗传刺激逃生行为在德索菲拉梅拉诺加斯特 ，J.Vis.Exp.（2013年）。

1. 生成通道霍多普辛苍蝇

1. 交叉 UAS-ChR2 与您选择的 Gal4 驱动程序一起飞行，我们使用 G105-Gal4，在视叶中的 Foma-1 神经元中表示。
2. 为了消除对蓝光刺激的视觉反应的可能性，两条飞行线都处于 w⁺norpA 背景中。
3. 最终结果^：w+诺帕：G105-加尔4/UAS-ChR2 +
4. 成年苍蝇关闭后，将选定的雌性放在新鲜食物上，辅以10μM全跨视网膜（ChR2所需的共因子），并防止光线照射，在进行行为检测前3天。

2. 制作 10 μM 全跨视网膜增强食品

1. 溶解100毫克全跨视网膜在17.6毫升95%乙醇，使20m视网膜。随时保护全跨视网膜免受光线的照射。
2. 将标准玉米粉在微波炉中飞食，让冷却至温暖触摸。
3. 将 50 μl 的 20 mM 全跨视网膜混合到 10 毫升飞行食物的瓶中。
4. 让小瓶冷却并防止光线照射。

3. 设备

1. Pipet 提示：标准 1，000 μl 管道尖端在尖端附近切割，形成直径约 2.25 毫米的孔径。
2. 平台（见图1）。
   1. Delrin 底座，17 厘米 X 25 厘米，每个角落都建有螺纹孔，可安装 1/4" 《不扩散条约》冷却剂软管连接器。
   2. 垂直支架由德林制成，连接到底座的中心。整体尺寸为 25 mm X 40 mm X 65 mm（宽 X 深度 X 高度）。10 毫米宽的凹槽运行支架的长度，底部有拇指螺丝。平台连接到支架顶部，25 毫米 X 40 毫米 X 10 毫米，直径 3.5 毫米的孔与支架中的凹槽对齐。
3. LED 阵列（见 图 1）。
   1. 使用冷却剂软管连接器将四臂冷却软管（约 18 厘米长）贴在平台底座上。冷却软管仅用作结构支撑，不用于冷却目的。
   2. 适当间隔的凹槽被切入每只手臂的最后一块冷却剂软管中，将一个散热器贴到每只手臂的末端。
   3. 蓝色 LED 叛军三星安装在每个散热器上，使用预切割热胶带。每个三星上都贴有一个卡克洛18°三镜头。
   4. LED 三星连接到巴克帕克直流驱动程序和指定的电源。我们已经安排了我们的设置与每个巴克帕克供电两个三星级系列。
   5. 在 700 mA 下照亮所有四颗 LED 三星，在我们的平台上产生 713 W/m² 的辐照。
4. 相机：相机安装在一个小三脚架上，聚焦在平台顶部。

4. 行为分析

1. 在冰上对苍蝇进行短暂麻醉。
2. 将单个苍蝇放在管道提示中，使用胶带关闭尖端的两端。
3. 苍蝇醒来后，正在积极探索管道尖端，取下胶带，将管道放在垂直支架的凹槽中。拇指螺爪用于固定管道尖端并关闭尖端底部。
4. 当苍蝇探索管道尖端（通常为 30 - 60 秒）时，在苍蝇从尖端浮出水面到平台之前启动摄像机录制。
5. 苍蝇飞上平台后，等待 1-2 秒，然后打开蓝色 LED。使用定时器手动测量时间，直到苍蝇启动飞行。

结果

图1：实验设置显示平台与垂直支架和四个冷却软管臂持有散热器与LED阵列贴在他们。 （A） 环境照明下的设置。（B） LED 亮起时的设置。（C） 散热器上三星 LED 的特写视图。（D） 三星特写，附有三镜头。（E） 巴克普克驱动程序和 LED 电路的示意图。（F） 巴克帕克和 LED 电路的电路图。 请单击此处查看此图的更大版本。

材料