Drosophila 光遗传学：一种操控神经环路的方法

摘要

来源：de Vries, S. E., Clandinin, T. 光遗传学刺激引发逃避行为 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2013).

光遗传学技术能够利用光来操控经过基因工程改造、表达特定视蛋白的神经元——这些视蛋白是光敏感蛋白，其光激活可引发神经元状态的改变。本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）中应用视蛋白Channelrhodopsin2的光遗传学方法。该示例实验方案采用光遗传学检测手段，旨在研究果蝇逃避行为背后的神经环路机制。

方案

本方案节选自 de Vries 和 Clandinin 的《逃逸行为的光遗传学刺激》 黑腹果蝇， J. Vis. Exp. (2013).

1. 生成通道视紫红质果蝇

1. 将 UAS-ChR2 果蝇与选定的 Gal4 驱动系杂交，我们使用 G105-Gal4，其在视叶的 Foma-1 神经元中表达。
2. 为了消除对蓝光刺激产生视觉反应的可能性，两个果蝇品系均处于 w⁺norpA 背景中。
3. 最终结果：w⁺norpA;G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. 成虫羽化后，选取雌蝇置于新鲜培养基中，添加 10 μM 全反式视黄醛（ChR2 所需的辅因子），避光饲养 3 天，然后进行行为学检测。

2. 制备10 μM 全反式视黄醛增强食物

1. 将100 mg全反式视黄醛溶于17.6 ml 95%乙醇中，配制成20 mM视黄醛溶液。全反式视黄醛须始终避光保存。
2. 用微波炉加热融化标准玉米粉果蝇饲料，冷却至触感温热。
3. 将50 μl 20 mM全反式视黄醛加入含10 ml果蝇饲料的试剂瓶中，混匀。
4. 让试剂瓶冷却，并避光保存。

3. 仪器设备

1. 移液器吸头：将标准的 1,000 μl 移液器吸头在尖端附近剪开，形成直径约为 2.25 mm 的孔。
2. 平台（见图 1）。
   1. 采用 Delrin 材料制作一个 17 cm × 25 cm 的底座，在每个角落设有螺纹孔，用于安装 ¼" NPT 冷却管接头。
   2. 一个由 Delrin 材料制成的垂直支架固定在底座中央，整体尺寸为 25 mm × 40 mm × 65 mm（宽 × 深 × 高）。支架沿长度方向设有一条宽 10 mm 的凹槽，底部配有拇指螺钉。支架顶部连接一个平台，尺寸为 25 mm × 40 mm × 10 mm，其上设有一个直径为 3.5 mm 的孔，与支架上的凹槽对齐。
3. LED 阵列（见图 1）。
   1. 使用冷却管接头将四段长约 18 cm 的冷却管固定在平台底座上。冷却管仅作为结构支撑，不用于冷却目的。
   2. 在每个支臂末端的冷却管部分切割出适当间距的凹槽，用于将散热片固定在每个支臂的末端。
   3. 使用预切好的导热胶带将蓝色 LED Rebel Tri-Stars 安装到每个散热片上，并在每个 Tri-Star 上安装一个 Carclo 18° 三透镜。
   4. LED Tri-Stars 按照规定连接至 BuckPuck 直流驱动器和电源。我们的装置中，每个 BuckPuck 以串联方式驱动两个 Tri-Stars。
   5. 四个 LED Tri-Stars 在 700 mA 电流下工作时，在平台上产生的辐照度为 713 W/m²。
4. 相机：将相机安装在一个小型三脚架上，并对准平台顶部进行聚焦。

4. 行为学实验

1. 将果蝇置于冰上进行短暂麻醉。
2. 将单只果蝇放入移液器吸头中，并用胶带封闭吸头两端。
3. 待果蝇苏醒并开始在吸头内活跃探索后，移除胶带，将吸头放入垂直支架的凹槽中。使用拇指螺丝固定吸头位置，并封闭吸头底部。
4. 当果蝇在吸头内探索时（通常为 30 - 60 秒），在果蝇即将从吸头爬出至平台前，启动摄像机开始记录。
5. 果蝇爬出至平台后，等待 1-2 秒，打开蓝色 LED 灯。使用计时器手动记录从开灯至果蝇启动飞行之间的时间。

结果

图1：实验装置示意图，显示带有垂直支架和四个冷却管臂的平台，冷却管臂上安装有带LED阵列的散热器。（A）在环境光照下的装置。（B）LED点亮时的装置。（C）散热器上Tri-Star LED的特写视图。（D）安装了三透镜组件的Tri-Star LED特写。（E）Buckpuck驱动器与LED电路的示意图。（F）BuckPuck与LED电路的电路图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>试剂</strong>
全反式视黄醛	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
<strong>设备</strong>
9.2 C/W 散热片	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm 方形 × 30 mm 高
Carclo 18&deg; 三透镜	Luxeonstar	10507
Tri-Star 基座蓝色 Rebel LED	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm，700 mA 下 174 流明
700 mA 降压恒流驱动器（BuckPuck DC Driver）	Luxeonstar	3021-D-E-700
BuckPuck 驱动器线束	Luxeonstar	3021-HE
预裁导热胶带	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm 六角基座
Snap-Loc 冷却液管，&frac14;" 内径	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc 冷却液管接头	McMaster-Carr	5307K39	&frac14;" NPT 外螺纹
实验室级开关模式可编程直流电源	BK Precision	1698
Exilim 相机	Casio	EX-FH20