C. elegans 胚裂球解剖：一种去除卵壳并解离胚胎细胞的方法

摘要

来源：Hsu, C. R.，等。利用分离的秀丽隐杆线虫胚胎分裂球和黏附性聚苯乙烯微珠体外重建空间细胞接触模式。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了一种从早期胚胎中分离秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚裂细胞的方法。所获得的细胞适用于细胞培养或离体（ex vivo）实验。

方案

本方案节选自 Hsu 等 体外 重建分离细胞的空间接触模式 秀丽隐杆线虫 胚胎卵裂球与粘附性聚苯乙烯微珠, 视频实验杂志 (2019).

1. 胚胎卵裂球的分离
2. 佩戴手套和实验服，以防止割伤以及接触漂白溶液。
   1. 用左右手各握住一根微毛细管（容量：10 µL）的一端。
   2. 将微毛细管向两端拉伸以施加张力，并将毛细管中心置于火焰上加热，从而制备两根手工拉制的毛细管（图1A).
   3. 用镊子在解剖显微镜下修剪手工拉制的毛细管尖端，并将拉制好的毛细管安装到口吸移液装置上。准备两种类型的移液管。移液管尖端开口大小应分别约为短轴长度的2倍和1倍 秀丽隐杆线虫 胚胎（30 µm）用于胚胎移植和卵壳去除 图1B-D).
   4. 将45 μL卵盐溶液用移液器滴加到多孔载玻片的一个孔中（图2A；底部）。
   5. 放置5-10只成虫 秀丽隐杆线虫 到含有卵盐溶液的孔中。
   6. 获得早期 秀丽隐杆线虫 胚胎，用两根针分别置于成虫右侧和左侧，将成虫切割成片段 秀丽隐杆线虫 身体并使针头相互滑动（图 2A；上部示意图。
   7. 将 45 μL 次氯酸盐溶液用移液器滴加到含有卵盐溶液的孔旁边的孔中图2B).
   8. 将45 μL Shelton生长培养基移液至含次氯酸盐溶液的孔旁边的接下来三个孔中图2B).
   9. 用手工拉制的胚胎移植毛细管通过口吸法将1细胞期和早期2细胞期胚胎转移至次氯酸盐溶液中图2B).
   10. 等待 40–55 秒。
   11. 用手工拉制的胚胎转移毛细管通过口吸移液法将胚胎从次氯酸盐溶液转移至谢尔顿生长培养基中，以洗涤胚胎。图2B).
   12. 再次用胚胎移植用手工拉制的毛细管通过口吸移液法将胚胎转移至Shelton培养基的新孔中，洗涤胚胎图2B).
   13. 将洗涤后的胚胎通过手工拉制的胚胎移植毛细管，用口吸法转移至Shelton培养基的新孔中。使用手工拉制的去壳毛细管，小心重复吹打以去除卵壳，图2C；中间为示意图）。如果卵壳被成功去除，胚胎细胞将变得更加圆润图2C；右侧）。
   14. 通过手工拉制的毛细管轻轻且持续地吹打，分离2细胞期胚胎的卵裂球以去除卵壳（图2D).

图1：卵裂球分离。（A）手工拉制玻璃毛细管。（B）用于胚胎转移的自制玻璃毛细管。（C）用于去除卵壳的自制玻璃毛细管。（D）示意图显示用于去壳操作的毛细管开口合适尺寸。箭头指示胚胎位置。比例尺为100 µm。

图2：卵裂球分离操作流程。 （A）在卵盐缓冲液中解剖成年 C. elegans 以获取胚胎。照片显示去除卵壳前的2细胞期和4细胞期胚胎。（B）次氯酸盐处理及洗涤步骤。（C）示意图展示卵壳去除的合适时机。照片显示去除卵壳后的4细胞期胚胎。（D）卵裂球分离。照片显示已分离的2细胞期胚胎。C和D中的箭头大小表示移液过程中所需施加的相对作用力。比例尺为50 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸液管组件	Drummond	21-180-13	用于卵裂球分离。
秀丽隐杆线虫品系：N2，野生型	秀丽隐杆线虫遗传中心	N2	本研究中使用的品系
秀丽隐杆线虫品系：KSG5，基因型：zuIs45; itIs37	本实验室	KSG5	本研究中使用的品系
校准微量移液管，10 µL	Drummond	21-180-13	用于卵裂球分离
CD脂质浓缩液	Life Technologies	11905031	用于卵裂球分离。在组织培养超净台中操作。
Clorox（次氯酸钠溶液）	Clorox	N. A.	用于卵裂球分离。当次氯酸盐处理效果不佳时，应开启新瓶。
盖玻片架	本实验室自制	N.A.	用于卵裂球分离。
体视显微镜：Zeiss Stemi 508 配 M 型支架，光源为内置LED，目镜放大倍数为10X	Carl Zeiss	Stemi 508	用于卵裂球分离。
胎牛血清，合格一次性装，加拿大来源	Gibco	A3160701	用于卵裂球分离。在组织培养超净台中操作。
通用及精密滑动式皮下注射针头，25号	BD	14-826AA	用于卵裂球分离
菊粉	Alfa Aesar	AAA1842509	用于卵裂球分离
MEM维生素溶液（100倍浓缩）	Gibco	11120052	用于卵裂球分离。
多孔载玻片，10孔	MP Biomedicals	ICN6041805	用于卵裂球分离
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）	Gibco	15140148	用于卵裂球分离。
聚乙烯吡咯烷酮	Fisher BioReagents	BP431-100	用于卵裂球分离
氯化钾	Bioshop	POC888	用于卵裂球分离
Schneider’s 果蝇无菌培养基	Gibco	21720024	用于卵裂球分离。在组织培养超净台中操作。
氯化钠	Bioshop	SOD001	用于卵裂球分离
氢氧化钠溶液，10 N	Fisher Chemical	SS255-1	用于卵裂球分离
注射器滤器，PTFE材质，非无菌	Basix	13100115	用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管路，配方E-3603，内径3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管路，配方E-3603，内径6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	用于卵裂球分离。