秀丽隐杆线虫肌肉面积测量：一种量化横纹肌形态的标准化方法

摘要

来源：Teoh, J. S. 等. 在 Caenorhabditis elegans中研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 视觉化实验杂志 (2019年)。

秀丽隐杆线虫 有两种类型的肌肉，即单肌节和多肌节，或横纹肌。  本视频描述了负责蠕虫运动的横纹体壁肌的排列方式’运动能力，并包含一个使用图像分析软件测量肌肉形态的示例实验方案。

方案

本方案节选自 Teoh 等 研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫, J. Vis. Exp. (2019).

1. 躯干肌肉结构的量化

1. 荧光 体壁肌肉结构成像
   1. 获得携带转基因的菌株（例如，RW1596） stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))，该方法用GFP标记肌球蛋白纤维。
      注意： 将外源基因导入动物体内可通过以下两种方法实现：将目标品系与已表达该外源基因的动物进行杂交，或向性腺远端臂显微注射DNA。由外源基因引起的“滚动”表型 rol-6 该转基因中的突变有助于肌肉的可视化。体壁肌肉沿背侧和腹侧分布，在野生型动物中通常难以观察，因为它们通常侧卧于一侧。 rol-6(su1006) 等位基因导致动物发生扭曲，从而暴露部分肌肉细胞以便成像。
   2. 使用配备高分辨率电荷耦合器件相机（CCD）、40倍或更高倍数物镜、GFP滤光片及图像采集软件的荧光显微镜对动物进行成像。
   3. 调整曝光时间和光照强度，以防止图像过饱和。
   4. 以400倍放大倍数拍摄并保存动物切片中至少包含一个完整可见斜肌细胞的肌肉图像。避免选择仅含不完整单个肌细胞的区域或焦距不清的切片区域。同时排除来自最前端和最后端区域以及靠近阴门区域的图像。
      注意： 如果动物体内没有一个可见的完整肌细胞，可轻轻滑动盖玻片以翻转动物，从而暴露一个完整的细胞。
2. 肌细胞面积的测量
   1. 在 Fiji 软件中打开图像 （本研究使用了2.0.0版本）。
   2. 使用多边形选择工具仔细勾勒单个斜肌细胞的轮廓。通过拖动锚点调整多边形线条的末端，以优化勾勒效果。
   3. 前往 分析 软件顶部的标签并点击 测量 计算所选区域的面积。将显示一个独立的结果表格，其中包含面积及其他测量数据。如果结果表格中缺少面积测量值，请前往 设置 测量 在……之下 分析 勾选“面积”复选框。同样，取消勾选其他不需要的测量选项。
   4. 对于发生退化/缺失区域的肌细胞，使用多边形选择工具勾勒缺失区域并点击 测量 再次。如果细胞内存在多个间隙，则需分别描记每个间隙。
   5. 计算单个肌细胞中空隙区域面积与整个细胞面积的比值。该比值较高表明肌细胞退变程度较高，提示细胞内存在较大空隙。若无缺失区域（如野生型动物中常见情况），则该比值为零。
      注意： 作为对照，还需通过肉眼观察评估肌肉结构缺陷，并将结果与定量测量进行比较。当实验室首次研究某一品系时，此步骤尤为有用。进行表型评分时，应根据肌丝结构的完整性判断动物是否为缺陷型。例如，若动物出现肌丝横纹结构模糊、GFP 聚集或因结构破坏导致肌细胞内出现空隙等情况，则记为缺陷型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP8	倒置平台
荧光显微镜	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
玻璃盖玻片 #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
玻璃盖玻片 #1.5	Zeiss	474030-9000-000	由 SCHOTT 生产
玻璃载玻片	Thermo scientifique	MENS41104A/40