表皮激光损伤：在 C. elegans 中诱导局部损伤以研究修复过程

摘要

来源：Xu, S. 和 Chisholm, A. D. 皮肤损伤方法及伤口反应检测分析 秀丽隐杆线虫. 视频实验杂志 (2014).

本视频介绍了一种激光损伤方法，可用于在蠕虫表皮造成非常精确的损伤。  示例方案来自一项关于伤口应答与修复的研究。

方案

本方案节选自Xu和Chisholm的研究， 皮肤损伤方法及伤口反应检测方案 秀丽隐杆线虫, J. Vis. Exp. (2014).

1. 激光损伤

注意：使用飞秒激光辐照（800 nm）进行更精确的损伤处理。

1. 在载玻片上用融化的2%琼脂制备琼脂垫。确保琼脂垫与用于活体成像的琼脂垫相似。 秀丽隐杆线虫.
2. 将10条年轻成虫线虫用线虫挑取工具转移到琼脂糖垫上，加入2 µl 12 mM 左旋咪唑溶液。用盖玻片覆盖线虫及液滴。等待1–2分钟，使线虫完全麻痹。
3. 将玻璃载玻片置于旋转盘共聚焦显微镜上。移动载物台以找到线虫，并使用100X物镜对准侧部前段或后段的合胞体表皮进行聚焦。 物镜（数值孔径 1.4-1.46）。
4. 将飞秒激光的功率设定为140 mW（在物镜前测量）。使用重复频率为80 MHz的飞秒激光。
   注意： 每次200毫秒、间隔20毫秒的两个脉冲在我们实验条件下足以造成损伤。
5. 聚焦于表皮细胞的顶端表面并损伤表皮。观察细胞质局部破裂（起泡）或所用任何荧光标记物的局部褪色现象。
   注意： 使用飞秒激光时，应遵循适当的激光安全操作规程。利用飞秒激光进行线扫描或点扫描（如双光子显微镜中的激光）可提供足够的功率以实现激光损伤。
   注意： 虽然我们没有使用其他激光器的直接经验，但原则上应可利用常规紫外激光（如用于 秀丽线虫 细胞消融）。可选地，使用旋转盘共聚焦显微镜上的光漂白后荧光恢复（FRAP）模块对表皮进行损伤处理（N. Pujol，个人交流）。