FITC-葡聚糖饲喂法：一种定量检测肠道通透性的方法 秀丽隐杆线虫

摘要

来源：Le, T. A. N., 等. 测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2019).

本视频介绍了一种通过喂食荧光素异硫氰酸（FITC）标记的葡聚糖来可视化并检测C. elegans肠道管腔完整性的方法。示例实验方案展示了使用3,3’-二吲哚基甲烷（DIM）处理并喂食病原菌的线虫进行该检测的过程。

方案

本实验方案节选自 Le et al，《测量细菌和化学物质对秀丽隐杆线虫肠道通透性的影响》，Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)。

1. 用于检测化学物质（DIM）对线虫肠道通透性影响的NGM平板的制备 秀丽隐杆线虫 喂食 P. aeruginosa
   1. 向500 mL玻璃瓶中加入0.5 g蛋白胨、0.6 g NaCl、195 mL蒸馏水、一个磁力搅拌子和6.8 g琼脂（NGM琼脂）。
   2. 向另一个500 mL玻璃瓶中加入0.5 g蛋白胨、0.6 g NaCl、195 mL蒸馏水和一个磁力搅拌子（不含琼脂），配制NGM液体培养基。
   3. 将两个瓶子（步骤1.1–1.2）、一个空的100 mL玻璃瓶和一个空的500 mL玻璃瓶在121 °C下高压灭菌15分钟。然后，将装有培养基的瓶子放入水浴中冷却至55 °C，持续30分钟。将琼脂培养基保留在水浴中，并取出装有液体培养基的瓶子（来自步骤1.2）用于下一步操作。
   4. 向NGM培养基中加入添加剂：0.4 mL 1 M CaCl₂₂，0.4 mL 乙醇中的胆固醇（mL），0.4 mL 1 M MgSO₄₄ 和10 mL 1 M KPO₄ （除乙醇中的胆固醇外，所有组分均需灭菌）。然后，在 55 °C 下使用磁力搅拌器将混合物充分搅拌。
   5. 用二甲基亚砜（DMSO）标记已灭菌的500 mL空玻璃瓶，用DIM标记已灭菌的100 mL空玻璃瓶。
   6. 将50 mL NGM肉汤转移至标有DIM的100 mL瓶中。向瓶中加入500 µL 20 mM DIM储备液，充分混匀。
      注意： DIM 溶于 DMSO 中（20 mM DIM 储存液）。
   7. 迅速将NGM琼脂培养基从水浴中取出，倒入50 mL至标有DIM的瓶子中，并充分混匀。
   8. 将含有DIM的NGM培养基各20 mL分装至每个90 mm × 15 mm的培养皿中。此步骤可制备约五个含DIM的NGM平板。
      注意： 每个NGM平板中DIM的终浓度为100 µM。
   9. 准备含DMSO的NGM平板时，将150 mL NGM肉汤转移至标有DMSO的500 mL瓶中，加入1.5 mL DMSO，充分混匀。
   10. 向标记为DMSO的瓶子中加入150 mL NGM琼脂培养基，并充分混匀。
   11. 在每个90 mm × 15 mm的培养皿中加入20 mL含DMSO的NGM培养基。此步骤可制备约十五块含DMSO的NGM平板。
       注意： 每个NGM平板中DMSO的最终浓度为0.5%。
   12. 在室温下凝固平板至少3小时，随后于4 °C保存直至使用。
       注意： 此处可以暂停实验方案。
   13. 移除 E. coli OP50 或 P. aeruginosa 从4 °C冰箱中取出PAO1菌液，充分涡旋混匀后涂布于NGM平板上。
   14. 加入800 µL的 E. coli OP50 或 P. aeruginosa 将PAO1菌液接种至每块新鲜的NGM琼脂平板上，置于20 °C培养箱中过夜干燥。
       注意： 此处可暂停该实验方案。对于第三个实验（图1），两个含有DMSO并涂有活菌的NGM平板 E. coli OP50，一皿含DMSO的NGM平板，涂布活菌 P. aeruginosa PAO1，以及一个含有DIM的NGM平板，涂布有活菌 P. aeruginosa PAO1 菌株已制备。
2. 细菌或DIM处理与FITC-葡聚糖饲喂
   1. 在添加了活体微生物的 NGM 平板上，将年龄同步的卵在 20 °C 下孵育 64 小时 大肠杆菌 以OP50作为食物
   2. 用S缓冲液清洗同步化至L4期的幼虫，并将它们（约500条以上）转移至含有不同细菌和化学物质的处理用NGM平板。在20 °C下培养48小时。
      注意： 处理时间可根据所用细菌和化学物质的不同，介于24至72小时之间。DIM的治疗或预防效果也可通过以下方式评估：先用病原体预处理线虫，再用DIM处理线虫（评估治疗效果）；或先用DIM预处理线虫，再用病原体处理（评估预防效果）。
   3. 为制备含FITC-葡聚糖的培养板，将2 mL热灭活的 大肠杆菌 OP50 加入 4 mg FITC-葡聚糖。然后，将 100 µL FITC-葡聚糖分装 E. coli 将OP50混合物加入二十个新的NGM琼脂平板（60 mm × 15 mm）中，并在洁净工作台上静置干燥1小时。
      注意： 每个NGM平板中FITC-葡聚糖的终浓度为20 μg/mL。
   4. 准备五个 E. coli 不含FITC-葡聚糖的OP50 NGM平板用于溶剂对照处理。为此，取100 µL热灭活的 E. coli 在洁净工作台上，将OP50涂布于每块新的NGM琼脂平板（60 mm × 15 mm）上，静置干燥1小时。
      注意： 每次独立实验需要十五个添加了FITC-葡聚糖的NGM平板和五个未添加FITC-葡聚糖的NGM平板。
   5. 在处理48小时后（自步骤2.2起），用S缓冲液洗涤线虫，将线虫转移至添加FITC-葡聚糖的平板以及不含FITC-葡聚糖的NGM平板，并将平板在常温下孵育过夜（14–15 h）。
      注意： 每个处理组需要进行5次FITC-葡聚糖染色（或溶剂对照喂养）重复实验。
   6. 用S缓冲液清洗线虫，然后将其转移至新鲜的NGM琼脂平板上爬行1小时。
      注意： 每次独立实验共需要 20 个新鲜的 NGM 平板。在此步骤中，您可以使用未添加或添加了的 NGM 平板 E. coli OP50
   7. 向黑色96孔平底板的每个孔中加入50 µL 4%甲醛溶液。从每块NGM平板转移约50条线虫至各孔，用于荧光检测。1至2分钟后，彻底移除各孔中的甲醛，并加入100 µL封片介质以覆盖孔壁。
      注意： 4% 甲醛溶液用于固定和 immobilize 线虫。每个处理组使用 5 个孔（5 个重复）进行图像分析。
3. 成像 秀丽隐杆线虫 使用Operetta成像系统通过检测FITC-葡聚糖荧光吸收测定肠道通透性
   注意：荧光体视显微镜可替代Operetta系统用于图像分析。
   1. 使用 Operetta 高内涵成像系统捕获荧光图像并测量荧光强度，并通过 Harmony 软件分析图像。
   2. 在 Harmony 软件中，按下该图标 打开盖子 打开盖子并将培养皿放入仪器中。
   3. 设置参数。
   4. 点击 设置，选择培养板类型（96孔Corning平底板）并添加通道（明场和EGFP通道）。
   5. 调整布局。前往 布局选择，然后选择 追踪 并调整参数（第一张图片为 1 µm，平面数为 10，间距为 1 µm）。
   6. 选择一个处理孔和一个捕获视野，然后按下 测试 检查图片是否令人满意 运行实验 部分
   7. 如果图像满意，返回到 设置 切片并按压 重置 屏幕末端的图标。然后，选择所有目标孔以及适当数量的捕获区域。
   8. 前往 进行实验 再次输入并输入板名称，然后按 开始 开始处理。
   9. 为了测量荧光强度，进入图像分析部分并导入图像。通过选择EGFP通道和方法B来识别细胞。将共同阈值调整为0.5，面积调整为 >200 µm²，分裂因子设为3.0，个体阈值设为0.18，对比度设为大于0.18。然后计算强度属性，并选择平均值作为输出。按下 应用 保存设置的图标。
   10. 前往 评估 通过获取热图和数据表来测量强度的区域。设置 读出参数 到 细胞 — EGFP强度细胞平均值 — 每孔平均值 并开始评估。
       注意： 此处可暂停该实验方案。
   11. 要从 Operetta 中提取数据，请单击 设置 按钮并选择 数据管理.
   12. 选择 写入归档，然后打开浏览器并选择该文件。
   13. 要选择文件，请点击小 + 左上角的信号，然后单击 测量 并选择 培养皿名称.
   14. 选择文件并单击 好的.
   15. 单击以选择保存文件的路径 浏览 激活通路中的信号
   16. 点击 开始 保存数据文件。
       注意： 此处可暂停实验方案。
4. FITC-葡聚糖荧光的统计分析 秀丽隐杆线虫
   1. 导入数据，并使用统计软件计算均值和标准差（SD）。
   2. 采用单因素方差分析（ANOVA）进行显著性差异分析，随后进行Tukey多重比较检验。

结果

图1：DIM对摄食P. aeruginosa的C. elegans肠道通透性的影响。 虫体的显微图像来自以下组别：（A）未饲喂FITC-葡聚糖的E. coli OP50组；（B）饲喂FITC-葡聚糖的E. coli组；（C）饲喂FITC-葡聚糖的P. aeruginosa PAO1组；以及（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,3’-二吲哚基甲烷 	Sigma	D9568
90×15 mm 培养皿	SPL Life Sciences, South Korea	10090
细菌琼脂	Beckton Dickinson	REF. 214010
甲醛溶液 	Sigma	F1635
秀丽隐杆线虫 N2	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）		野生型 
胆固醇	Sigma	C3045
Costa 检测板，96 孔黑色带透明平底未经处理的聚苯乙烯板，无盖	Corning Incorporated	REF. 3631
二甲基亚砜	Sigma	D2650
大肠杆菌 OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	Sigma	FD10S
Harmony 软件 	PerkinElmer		版本 3.5
七水合硫酸镁 	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount 水性封片介质	Sigma	F4680
Operetta CLS 高内涵分析系统	PerkinElmer	 HH16000000
蛋白胨	Merck	EMD 1.07213.1000
铜绿假单胞菌 PA01	韩国典型培养物保藏中心	KCTC NO. 1637
氯化钠	Fisher Bioreagents	BP358-1
体视显微镜	Nikon, Japan	SMZ800N