FITC-德克斯特兰喂养：量化C.elegans肠道渗透性的方法

摘要

资料来源：北卡罗来纳州勒等地。测量细菌和化学物质对卡诺哈布迪炎的肠道渗透性的影响。J. 维斯(2019). 

该视频引入了一种方法，通过喂养含有 FITC 标签的 dextran 蠕虫来可视化和测量 C. elegans 肠流明的完整性。 示例协议显示了用 3，3'-丁二甲烷 （DIM） 处理和病原体喂养的蠕虫进行的检测。

方案

本协议是勒等人的摘录，衡量细菌和化学物质对肠渗透性的影响，卡诺哈布迪炎，J.Vis.Exp。(2019).

1. 准备NGM板测试化学品（DIM）对C.埃莱甘斯美联储肠道渗透性的影响与P.阿鲁吉诺萨
   1. 在 500 毫升玻璃瓶 （NGM agar） 中加入 0.5 克 pepton、0.6 克 NaCl、195 毫升蒸馏水、磁搅拌器和 6.8 克 agar。
   2. 加入 0.5 克 peptone、0.6 克 NaCl、195 毫升蒸馏水和无阿加的磁搅拌器到另一个 500 毫升玻璃瓶 （NGM 肉汤）中。
   3. 自动将两个瓶子（从步骤 1.1+1.2 起）、一个空的 100 毫升玻璃瓶和一个空的 500 毫升玻璃瓶在 121 °C 下 15 分钟。 然后，让装有瓶子的介质在水浴中冷却至 55 °C 30 分钟。将 agar 介质保存在水浴中，并取出含有汤的瓶子（从步骤 1.2 开始），以进行下一步。
   4. 将添加剂化学物质添加到 NGM 汤中：0.4 mL 的 1 M CaCl₂、0.4 mL 乙醇中的胆固醇 （mL）、0.4 mL 的 1 MgSO₄和 10 mL 的 1 M KPO_4（所有这些组件必须除乙醇中的胆固醇外进行灭菌）。然后，在 55 °C 时用磁搅拌器彻底搅拌混合物。
   5. 将自动切割的空 500 毫升玻璃瓶与二甲基硫氧化物 （DMSO） 和带 DIM 的自动切割的空 100 mL 玻璃瓶贴上标签。
   6. 将 50 mL 的 NGM 汤转移到 DIM 标记的 100 mL 瓶中。将 500 μL 的 20 mM DIM 库存添加到瓶子中，并混合均好。
      注：DIM 溶于 DMSO（20 mM DIM 库存）。
   7. 快速从水浴中取出 NGM agar 介质，将 50 mL 的 NGM agar 介质添加到 DIM 标记的瓶子中，然后彻底混合。
   8. 将含有 DIM 的 NGM 介质的 20 mL 别名放入每个 90 mm x 15 mm 培养皿中。大约五个含DIM的NGM板可以从这一步骤。
      注：每个 NGM 板中的 DIM 最终浓度为 100 μM。
   9. 要准备含 DMSO 的 NGM 板，请将 150 mL 的 NGM 汤转移到 DMSO 标记的 500 mL 瓶中。将 1.5 mL 的 DMSO 添加到瓶子中并混合均好。
   10. 将 150 mL 的 NGM agar 介质添加到 DMSO 标记的瓶子中，然后彻底混合。
   11. 在每道90毫米×15毫米的培养皿中放置一个含有DMSO的NGM介质的20mL别名。大约15个含DMSO的NGM板可以从这一步骤。
       注：每个 NGM 板块中 DMSO 的最终浓度为 0.5%。
   12. 在室温下将盘子凝固至少3小时，并将它们存放在4°C，直到使用。
       注：协议可在此处暂停。
   13. 从 4 °C 冰箱中取出大肠杆菌OP50 或P. aeruginosa PAO1 培养，在扩散到 NGM 板上之前，将培养基正确漩涡。
   14. 将大肠杆菌OP50 或P. aeruginosa PAO1 细菌培养的 800 μL 放入每个新鲜的 NGM agar 板上，让板在 20 °C 的孵化器中干燥过夜。
       注：协议可在此处暂停。在第三个实验（图1）中，准备了两个含有DMSO的NGM板，上面涂有活大肠杆菌OP50，一个含有DMSO的NGM板涂有活的P.aeruginosa PAO1，以及一个含DIM的NGM板，上面涂有活的P.aeruginosa PAO1。
2. 细菌或DIIM和FITC-德克斯特兰喂养的治疗
   1. 在 NGM 板上以 20 °C 的 64 小时孵育年龄同步鸡蛋，并辅以活大肠杆菌OP50 作为食物。
   2. 用 S 缓冲器清洗年龄同步的 L4 幼虫，并将它们（约 500 多种蠕虫）转移到含有不同细菌和化学物质的治疗 NGM 板中。在20°C下孵育48小时。
      注：根据所使用的细菌和化学物质，治疗时间从24小时到72小时不等。DIM 的治疗或预防效果也可以通过用病原体预处理蠕虫，然后用 DIM（治疗效果）治疗蠕虫，或者用 DIM 预处理蠕虫，然后用病原体治疗（预防效果）来评估。
   3. 要准备 FITC-德克斯特伦补充板，将 2 mL 的热灭活大肠杆菌OP50 与 4 毫克 FITC-德克斯特伦混合。然后，将 FITC-dextran 和大肠杆菌OP50 混合物的 100 μL 分成 20 个新鲜的 NGM agar 板（60 mm x 15 mm），让板在干净的长凳上干燥 1 小时。
      注：FITC-德克斯特伦在每个NGM板的最终浓度为20微克/mL。
   4. 准备五个含大肠杆菌OP50 的 NGM 板，无需 FITC-德克斯特伦进行车辆控制处理。为此，将 100 μL 热灭活大肠杆菌OP50 划分到每个新鲜的 NGM agar 板（60 mm x 15 mm），并让板在干净的长凳上干燥 1 小时。
      注：对于每个独立的实验，需要15个FITC-德克斯特兰补充的NGM板和5个没有FITC-德克斯特伦的NGM板。
   5. 经过 48 小时的治疗（从步骤 2.2 开始），用 S 缓冲器清洗蠕虫，将蠕虫转移到 FITC-dextran 补充板和无 FITC-dextran 的 NGM 板，并在夜间（14-15 h）孵化板。
      注：对于每个治疗组，需要 5 个 FITC-德克斯特伦染色（或车辆控制喂养）的复制品。
   6. 用 S 缓冲器清洗蠕虫，并允许它们在新的 NGM agar 板中爬行 1 小时。
      注：对于每个独立的实验，总共需要 20 个新鲜的 NGM 板。在此步骤中，您可以使用无大肠杆菌OP50 补充的 NGM 板。
   7. 在黑色 96 井平底板的每口井中加入 50μL 的 4% 甲醛溶液。将大约 50 种蠕虫从每个 NGM 板转移到每个井中，用于荧光测量。1 至 2 分钟后，彻底去除每口井中的所有甲醛，并加入 100 μL 的安装介质涂抹油井。
      注：甲醛溶液 （4%）用于固定和修复蠕虫。对于每个治疗组，5口井（5个复制品）用于图像分析。
3. 通过测量 FITC-dextran 荧光吸收，使用奥佩雷塔成像系统成像C. elegans和确定肠道渗透性
   注：荧光立体镜检查可用于图像分析，而不是奥佩雷塔系统。
   1. 使用 Operetta 高含量成像系统捕获荧光图像并测量荧光强度，并使用 Harmony 软件分析图像。
   2. 在 Harmony 软件中，按下图标打开盖子并将板放入机器中。
   3. 设置参数。
   4. 单击设置，选择板型（96 井玉米平底），并添加通道（光明场和EGFP通道）。
   5. 调整布局。转到布局选择，然后选择"跟踪"并调整参数（第一张图片为 1 μm，平面数量为 10，距离为 1 μm）。
   6. 选择一个处理井和一个捕获场和按测试，以检查图片是否令人满意的运行实验部分。
   7. 如果图片令人满意，请返回设置部分，并在屏幕末尾按重置图标。然后，选择所有目标井和适量的捕获字段。
   8. 再次转到运行实验并输入板名，然后按"开始"开始处理。
   9. 要测量荧光的强度，转到图像分析部分并输入图像。通过选择EGFP通道和方法B找到细胞。 将通用阈值调整为0.5，区域调整为 >200 μm^2，拆分因子调整为3.0，单个阈值调整为0.18，对比度超过0.18。然后，计算强度属性并选择均值作为输出。按应用图标以保存设置。
   10. 转到评估部分，通过获取热图和数据表来测量强度。将读出参数设置为单元格——强度细胞EGFP均值——均值每井并开始评估。
       注：协议可在此处暂停。
   11. 要从 Operetta 提取数据，请单击"设置"按钮并选择数据管理。
   12. 选择"写"存档，然后打开浏览并选择文件。
   13. 要选择文件，请单击左角的小+信号，然后单击"测量"并选择板名。
   14. 选择文件并单击"确定"。
   15. 通过单击活动路径上的浏览信号来选择保存文件的路径。
   16. 单击"开始"以保存数据文件。
       注：协议可在此处暂停。
4. C. elegans的 FITC-德克斯特兰荧光统计分析
   1. 导入数据并使用统计软件计算平均值和标准偏差 （SD）。
   2. 通过对方差 （ANOVA） 的单向分析分析显著差异，然后进行 Tukey 的多重比较测试。

结果

图1：DIM对C.elegans喂养P.阿鲁吉诺萨的肠道渗透性的影响。来自（A）大肠杆菌OP50 的蠕虫的显微镜图像，没有 FITC-dextran 喂养，（B）大肠杆菌与 FITC-德克斯特兰喂养，（C） Aeruginosa PAO1 与 FITC-德克斯特兰喂养，以及（D） P. 阿鲁吉诺萨和 DIM （100 μM） 与 FITC-德克斯特兰喂养的共处理。比例杆 = 1 毫米（白色）和 200μm（黑色）。年龄同步的L4幼虫...

材料