性腺显微注射：一种将化合物直接递送至线虫 C. elegans 生殖系的方法

摘要

来源：Farboud, B. 等，在多种细胞与生物中利用Cas9核糖核蛋白增强基因组编辑。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了显微注射技术，这是一种创建转基因C. elegans品系的常用方法。在该示例中，我们将看到通过显微注射引入核糖核蛋白（RNP）复合物，以实现基于CRISPR的基因编辑。

方案

以下方案节选自 Farboud et al 的视频文章《在多种细胞与生物体中利用 Cas9 核糖核蛋白增强基因组编辑》，J. Vis. Exp. (2018)，https://www.jove.com/video/57350/enhanced-genome-editing-with-cas9-ribonucleoprotein-diverse-cells。

1. 核糖核蛋白复合物组装

1. 提前精心设计实验，预先获取所有RNA、DNA和蛋白质组分。初次尝试时，可选用表1中列出的一种阳性对照，并使用材料表中所述的商业试剂，以确保实验设计的可靠性及试剂的完整性。有关新基因组编辑实验设计的更多建议，请参阅相关主题的文献。
   ​注意： 按照后续步骤组装完成后，预先制备的核糖核蛋白复合物（RNP）可保存于 -80 °C。
   1. 在选定目标基因后，使用一种免费的在线工具设计最优的gRNA。如果希望产生基因敲除，务必靶向外显子区域。
      注意： 这些工具将有助于识别具有相邻位点的目标区域 S. pyogenes PAM序列、高质量分值和低脱靶分值
   2. 纯化 S. pyogenes 通过已发表的方法制备Cas9蛋白，或从商业供应商处购买。
   3. 配制用于RNA稀释、RNP复合物制备及蛋白保存的典型Cas9缓冲液，其中包含20 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM KCl、10%甘油和1 mM TCEP。用于重悬或稀释RNA的缓冲液必须始终使用无核酸酶水，以防止RNA降解。
   4. 通过体外转录或化学合成方法制备向导RNA（tracrRNA与crRNA，或单链向导RNA，sgRNA） 体外 使用已发表的方法进行转录，或从核酸合成公司购买。
   5. 若要插入基因，需合成或购买供体DNA模板。
   6. 将蛋白和RNA分装样品于-80 °C保存，使用前在冰上立即解冻。
      ​注意： 每次冻融都会略微降低效率。Cas9 蛋白纯化及以下实验的详细开放获取方案： 体外 sgRNA的转录信息可参见其他文献。
2. RNP 制备用于 秀丽线虫 编辑：按以下顺序加入试剂，配制终体积为 20 µL 的 RNP 复合物（括号内为终浓度）：Cas9（2 µM）、HEPES pH 7.5（10 µM）、KCl（115 µM）、crRNA（12 µM）、tracrRNA（40 µM）以及修复模板 如有需要 （0.5 µM 单链DNA或最高350 ng/µL 双链DNA）
   ​注意： Cas9介导的双链断裂（DSB）依赖模板修复的效率与双链DNA修复载体的浓度成正比；因此，修复模板浓度越高，模板化修复效率也越高。然而，已有研究表明，注射液中双链DNA浓度超过350 ng/µL时，会导致被注射线虫的存活率下降。因此，为在最大化修复效率的同时尽量降低致死率，建议混合液中双链DNA的浓度不超过350 ng/µL，但可使用接近该浓度的最高有效剂量。
   1. 根据共CRISPR/共转化筛选实验的需要，可添加多种crRNA以同时靶向多个位点。当添加多种crRNA时，应依次将每种crRNA逐个加入主混合液中。
      ​注意： 每种crRNA的用量无需相同，即使在不改变Cas9浓度的情况下将总crRNA浓度在预混液中加倍，似乎也不会影响特定基因座的突变频率。相关示例详见Paix 等
   2. 用移液器吹打混匀，然后在16,000 × g下离心5秒，确保溶液聚集在管底。
   3. 37 °C 下孵育溶液 15 分钟。
   4. 以 16,000 x g 离心 1 分钟，使可能堵塞微注射细针的颗粒物质沉淀。后续步骤使用上清液。
3. 秀丽隐杆线虫 准备

1. 显微注射前一天：制备显微注射用琼脂糖垫片。

1. 通过将琼脂糖加入水中，并在电热板或微波炉中加热至沸腾，制备3% (w/v)的琼脂糖水溶液。
2. 将24 mm × 50 mm × 1.5 mm的盖玻片平放在桌面上，用玻璃巴斯德吸管吸取少量（约15 µL）琼脂糖溶液滴加到盖玻片上。迅速将另一张盖玻片覆盖在液滴上将其压平。待琼脂糖凝固后，取下其中一张盖玻片。
3. 将带有琼脂糖涂层的盖玻片正面朝上放置于桌面过夜干燥。24小时后，将琼脂糖垫片存放在洁净干燥的容器中。
   注意：此琼脂糖垫片可无限期使用。

2. 拉制显微注射针：使用带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.58 mm），参照Mello和Fire⁵⁷及其他文献方法拉制针尖。制备后的注射针可立即使用，也可保存在洁净干燥的容器中，并用黏土支架固定。

3. 为维持线虫生长，需准备倒入培养皿中的线虫生长培养基（NGM）琼脂，并接种OP50细菌（有关标准C. elegans培养方法及培养基配方，请参见Stiernagle）。

4. 准备用于显微注射的线虫：在显微注射前12–24小时，挑选处于L4期的雌雄同体线虫，转移到含有OP50细菌的新NG-琼脂平板上，并于20 °C过夜培养。针对每个Cas9靶点/注射混合物，每板挑选约30条线虫。

4. 显微注射当天： 用第1.2步制备的RNP溶液上清液填充拉制好的显微注射针。
   1. 将第1.2.4步获得的上清液用移液器吸入拉制的毛细移液管中，并从毛细移液管将溶液反向填充至准备好的显微注射针中（通常加载量少于0.1 µL）。
5. 将装有溶液的注射针安装到连接于显微操作器的显微注射装置上。将注射装置的压力设定为250 kPa，平衡压力设定为25 kPa。
6. 回折已装液的注射针尖以形成锐利的针缘。将一块15 mm × 15 mm × 1.5 mm的方形盖玻片置于一块24 mm × 50 mm × 1.5 mm的盖玻片之上。
   1. 用卤代烷油700覆盖方形盖玻片的一侧边缘。
   2. 将注射针置于油中，位于15 mm方形盖玻片的边缘处。
   3. 用手控制显微镜载物台和盖玻片，一边踩下注射踏板/按钮，一边将载玻片沿针尖边缘轻轻上推并滑动，使针尖回折，增加液体从针尖流出的流量。通过调节使注射混合液沿针缘稳定流出，形成约每秒1个气泡的流速，以达到最佳流速。
7. 确认在显微注射前12–24小时挑选的L4期线虫在注射当天已发育为发育阶段一致的年轻成虫。将年轻成虫转移至不含OP50细菌的NG-琼脂平板上，让其爬行5分钟。此步骤可减少转移至注射垫上的细菌量，从而降低针头堵塞的风险。
8. 将琼脂糖注射垫/盖玻片置于解剖显微镜下。使用线虫挑取工具，在垫的一侧边缘铺设一条细小的卤代烷油轨迹。
9. 使用涂有油的线虫挑取工具，将数条线虫从NG-琼脂平板上挑起并移入油迹中。利用连接在移液器上的细毛（如睫毛或猫须），将线虫并排摆放，并轻轻将其推入琼脂糖垫中。在尚未熟练掌握显微注射操作前，建议每次仅固定并注射一条线虫。
   ​注意：干燥的琼脂糖会吸收线虫体表的水分，导致线虫粘附于垫上。因此操作必须迅速，以防线虫脱水。
   1. 线虫定位并粘附于垫上后，用线虫挑取工具的尖端再滴加几滴卤代烷油（约20 µL）覆盖线虫。
10. C. elegans 生殖腺显微注射RNP及注射后处理
    本显微注射方案改编自Mello和Fire的方法，其他文献中已有详细描述。
    1. 将载有线虫的盖玻片置于注射显微镜上。在低倍镜下（5X物镜，10X目镜），将线虫调整至与注射针垂直的位置。
       1. 切换至高倍镜（40X物镜，10X目镜），重新调整注射针位置，使其紧邻生殖腺臂中对应中期至晚期粗线期细胞核的区域。
       2. 使用显微操作器将注射针推向线虫，轻微压陷角质层。随后，用一只手轻敲显微镜载物台侧面，使针尖刺穿角质层。踩下注射踏板/按钮，缓慢将注射混合液注入生殖腺臂，然后撤出针头。
       3. 对另一侧生殖腺臂重复此操作。
    2. 注射完成后，取下盖玻片/琼脂糖垫，将其转移至解剖显微镜下。
       1. 使用拉制的毛细移液管，通过滴加M9缓冲液冲洗线虫表面的油，以去除油层。此处理有助于释放粘附于垫上的线虫。
       2. 10分钟后，当线虫在缓冲液中活跃游动时，使用拉制的毛细移液管将其转移至含有OP50细菌的NG-琼脂平板上。将平板置于20 °C环境中培养2–3小时，直至线虫恢复活动。
    3. 恢复活动后，将每条线虫单独转移至含OP50细菌的NG-琼脂平板，并将平板转移至25 °C培养箱中。
    4. 让P₀代注射线虫生长并产卵3天。筛选F₁代子代。
       1. 若采用共CRISPR（co-CRISPR）或共转化（co-conversion）策略，则根据参考基因的突变表型选择候选线虫进行筛选。将这些具有标记表型的线虫单独转移至新的含OP50细菌的NG-琼脂平板上，于20 °C下培养使其产下F₂代子代。
          注意：用于共CRISPR筛选或选择的表型应能早期评估Cas9编辑的成功率。
       2. 若未观察到共CRISPR表型，可显微注射阳性对照质粒以帮助提高注射效率。
          注意：例如，在注射混合液中加入编码mCherry标记的MYO-2的质粒，有助于评估注射效率。成功注射pCFJ90质粒的线虫，其部分子代将表现出咽部荧光。
    5. 检测F₁代线虫中是否存在目标编辑。挑选单条F₁代母虫至96孔板的单独孔中，裂解后通过特异性插入片段PCR扩增、DNA测序分析或Surveyor核酸酶检测（CEL-1）分析其DNA。
       注意：这些检测方法适用于采用共CRISPR/共转化或其他筛选或选择策略的情况。

结果

表1：初步基因组编辑实验的阳性对照。 本表列出了在本实验方案所述的各种细胞和生物中首次进行基因组编辑实验所需的关键信息。遵循这些参数通常可获得成功的结果，可用于验证实验方案，或作为研究者后续针对自身感兴趣基因进行编辑时的基准对照。F：正向，R：反向，HDR：同源定向修复。 请点击此处查看此表格的高清版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂/材料</strong>
DNA寡核苷酸	Integrated DNA Technologies	-	IDT 将提供定制的 DNA 序列，包括表 1 中的序列
向导RNA	Synthego	-	Synthego 将提供高质量的 S. pyogenes Cas9 sgRNA，包括含有表 1 中所列靶向序列的定制 sgRNA
纯化的Cas9蛋白（EnGen&nbsp;Cas9 NLS,&nbsp;S. pyogenes	新英格兰生物科学公司	M0646T	如果可能，自行纯化 Cas9 或从本地核心设施购买是成本较低的选择
OP50&nbsp;大肠杆菌	秀丽隐杆线虫遗传学中心	OP-50	https://cgc.umn.edu/
培养线虫的琼脂培养基培养皿	-	-	参见 Stiernagle, T（参考文献 59）
带玻璃丝的标准硼硅酸盐玻璃毛细管：&nbsp; 4 英寸（100 毫米），外径/内径 1/0.58	World Precision Instruments	1B100F-4
单管玻璃毛细管：6 英寸（152 毫米），外径/内径 2/1.12&nbsp;	World Precision Instruments	1B200-6&nbsp;
盖玻片；24 &times; 50 mm	赛默飞世尔科技	12-544E
盖玻片；22 &times; 22 mm	赛默飞世尔科技	12-518-105K
Apex LE 琼脂糖	Genesee Scientific	20-102
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich&nbsp;	H8898-100ML
pCFJ90 质粒	Addgene	19327
带纤维丝的毛细管：4 英寸（1.0 毫米）&nbsp;	World Precision Instruments	T2100F-4
培养皿（100 &times; 15 mm	-
9" 巴斯德吸管	-
无核酸酶水	-
<强>仪器设备</strong>
MZ75&nbsp;体视显微镜	Leica&nbsp;	已停产。当前型号为 M80 体视显微镜
Axio Vert35 倒置相差荧光显微镜	Zeiss	已停产。当前型号为 Axio VertA.1
基于激光的微毛细管拉制仪（用于秀丽隐杆线虫实验方案）	Sutter Instrument&nbsp;	FG-P2000
皮升注射仪（用于 C. elegans 实验方案）	Warner Instruments	PLI-100A
三轴操纵杆油压液压显微操作器	Narishige International	MO-202U
粗调操纵器	Narishige International	MMN-1
微量移液器吸头	Eppendorf	5242956003
NG-琼脂