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戈纳德微注射：一种化合物输送方法，直接进入C.elegans的细菌线

2023年4月30日

本文内容

摘要

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资料来源：法布德，B 等人， 增强基因组编辑与Cas9核糖蛋白在不同的细胞和生物体。 J. 维斯 (2018).

该视频描述了微注射，一种创建转基因 C.elegans 菌株的常见方法。 在示例中，我们将看到用于引入核糖核蛋白 （RNP） 复合物用于 CRISPR 碱基因编辑的微注射。

方案

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以下协议是法布德等人的摘录，增强基因组编辑与Cas9核糖核蛋白在不同的细胞和生物体，J.Vis.Exp.（2018年）。

1. RNP 大会

  1. 提前设计实验，提前获取所有RNA、DNA和蛋白质成分。作为第一关，请尝试表 1 中列出的正控件之一，并使用材料表中描述的商业试剂，以确保可靠的实验设计和材料的完整性。有关规划新的基因组编辑实验的其他提示，请参阅有关此主题的论文。
    注：一旦按照后续步骤描述组装，提前准备的 RNP 可存储在 -80 °C。
    1. 在选择要瞄准哪个基因后，使用其中一个免费的在线工具来设计最佳的 gRNA。如果希望产生淘汰，请务必瞄准exon。
      注： 这些工具将有助于识别具有相邻的 S. pyogenes PAM 序列、高质量分数和低目标得分的目标站点。
    2. 通过已发布的方法净化S. pyogenes Cas9 蛋白质，或....

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结果

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表1：初步基因组编辑实验的正控制。此表显示了在本协议中描述的每个细胞和生物体中执行首次基因组编辑实验所需的关键信息。遵循这些参数可能会产生一个成功的结果，可用于测试协议或作为比较的基线，一旦实验者瞄准自己感兴趣的基因。F： 前进， R： 反向， HDR： 同源定向修复. 请单击此处查看此表的较大版本。

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材料

<表格 border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1040px;" width="1039"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 试剂/材料 DNA 寡核苷酸 集成 DNA Technologies - IDT 将提供自定义 DNA 序列，包括表 1 中的序列 < 高度="77"> 引导 RNA 合成 - Synthego 将为化脓性链球菌 Cas9 提供高质量的 sgRNA，包括包含表 1 中所含靶向序列的定制 sgRNA 纯化的 Cas9 蛋白（EnGen Cas9 NLS，化脓性链球菌） 新英格兰生物科学公司 M0646T 如果可能的话，在内部纯化 Cas9 或从当地核心设施购买是一种更便宜的选择 OP50 大肠杆菌 Caenorhabditis 遗传学中心 OP-50 https://cgc.umn.edu/ 培养皿中的线虫生长培养基琼脂 - - 参见 Stiernagle， T （参考文献 59） 带细丝的标准硼硅酸盐玻璃毛细管:4 英寸（100 毫米），1/0.58 外径/内径 World Precision Instruments 1B100F-4 单管标准硼硅酸盐玻璃毛细管:6 英寸（152 毫米），2/1.12 外径/内径 World Precision Instruments 1B200-6 盖玻璃;24 × 50 毫米 Thermo Fisher Scientific 12-544E 盖玻璃;22 × 22 毫米 Thermo Fisher Scientific 12-518-105K Apex LE 琼脂糖 Genesee Scientific 20-102 卤烃油 700 西格玛-奥德里奇 H8898-100ML pCFJ90 质粒 Addgene 19327 带细丝的毛细管:4 英寸（1.0 毫米） World Precision Instruments T2100F-4 培养皿（100 × 15 mm） - 9" 巴斯德移液器 - 无核酸酶水 - 设备 MZ75 体视显微镜 徕卡 已停产。当前型号是 M80 体视显微镜 Axio Vert35 倒置相差荧光显微镜 蔡司 已停产。当前型号为 Axio VertA.1 激光微量移液器拉拔器（用于秀丽隐杆线虫方案） 萨特乐器 FG-P2000 Picoliter 显微注射器（用于秀丽隐杆线虫方案） 华纳仪器 PLI-100A 三轴纵杆油压显微作器 成重国际 MO-202U 粗略机械手 成重国际 MMN-1 Microloader 移液器吸头 Eppendorf 5242956003 NG-琼脂

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