光运动反应检测：一种测量斑马鱼幼鱼对光照条件突然变化行为反应的方法

摘要

来源：Steele, W. B.，等。幼鱼行为反应谱检测的实验方案：以神经兴奋剂咖啡因为例 。J. Vis. Exp. （2018）。

本视频介绍了使用自动追踪软件对斑马鱼和黑头软口鱼幼体进行光运动反应检测的方法。该方案通过测量幼鱼在光照条件突然变化后的行为反应来评估其行为特征。

方案

1. 视频追踪参数的校准

1. 在进行行为学测量之前，在视频追踪软件中设置观察和校准参数（参见材料表）。
   1. 将一个孔板放入记录室中，每个孔内至少放置一条幼鱼。使用该孔板及其中的鱼作为设置校准参数的参考。
   2. 在视频追踪软件中，点击 "文件 | 生成协议"，将弹出“协议创建向导”对话框。在 "位置计数"字段中输入孔板的孔数，然后点击 "确定"。
   3. 在屏幕顶部，点击 "视图 | 全屏"，系统将显示孔板的俯视摄像画面。
   4. 点击 "绘制区域"图标，该图标显示为三个不同颜色的形状。在孔板视图区域右侧，选择标签为 "区域"字段中的圆形图标。
   5. 使用光标在孔板左上角的孔中划定圆形视频追踪区域。选择 "右上标记"，然后勾勒右上角孔的观察区域。接着选择 "底部标记"以勾勒右下角孔的区域。
      注意：绘制圆形轮廓后，通常需要调整其位置。  若要调整轮廓位置，请点击“选择”，然后使用光标移动所划定的区域。此外，可通过点击 "复制"，然后点击 "粘贴"来复制轮廓。 
   6. 在定义了左上、右上和右下孔的追踪区域后，点击 "生成"，软件将自动划分其余孔的观察区域。
   7. 在标签为 "校准"的区域中，点击 "绘制标尺"。使用光标在孔板上绘制一条水平线。绘制完成后，将弹出标有“校准测量”的对话框。输入孔板的长度，然后点击 "确定"。
   8. 通过点击 "绘制区域"图标退出绘图管理器。
   9. 点击 "平铺"图标。  使用光标选中视图屏幕上出现的所有方框，使每个方框变为绿色。
      注意：平铺图标显示为六个独立的小方块组成的组
   10. "点击 视图| 全屏"。   在孔板视图区域右侧，点击标签为 "Bkg"的 "检测阈值"框。使用阈值调节条设置像素检测阈值。选定合适的像素检测阈值后，点击 "应用至组"。
       注意：本方案在斑马鱼观察中将检测阈值设为黑色模式下的13，在胖头 minnow 观察中设为透明模式下的110。
   11. 在标签为 "运动阈值"的框中，输入所需的运动速度追踪参数。设置速度参数后，点击 "应用至组"。
       注意：本方案将小/大运动设为20 mm/s，静止/小运动设为5 mm/s。这些设置使软件能够以三种不同速度水平追踪幼鱼的运动：静止（冻结）= <5 mm/s，小运动（巡航）= 5–20 mm/s，大运动（爆发）= >20 mm/s。
   12. 从下拉菜单中点击 "参数 | 协议参数"。在弹出的对话框中，选择 "时间"选项卡。输入观察时间和积分时间。参数输入完成后，点击 "确定"。
   13. 要设置每个光周期的明/暗时间及光照强度，请从 "参数"下拉菜单中选择 "光驱动"，以打开光驱动设置对话框。
       注意：参见协议视频以了解如何设置多个明暗光周期。
   14. 在视频追踪参数设置完成后，保存观察协议。
       注意：本协议观察鱼类行为持续50分钟，包括10分钟的适应期，随后是4个交替的明/暗阶段，包含两个10分钟的光照期和两个10分钟的黑暗期。积分时间设置为在50分钟行为试验中每分钟测量一次行为。

2. 幼鱼运动行为与趋光行为的观察

1. 将含有实验鱼的培养板放入行为记录室中。
2. 在视频追踪软件中，打开下一步中建立的追踪方案。
3. 在视频追踪查看界面中，检查确认所有幼鱼在计算机屏幕上均清晰可见，每个孔中仅有一条个体幼鱼，且各个孔的位置与步骤 1.1.5 和 1.1.6 中定义的观察区域对齐。
4. 点击 "Experiment | Execute"。
   注意：系统将提示用户输入观察数据的保存名称和存储位置。
5. 指定观察数据的名称和保存位置后，点击计算机屏幕顶部的 "Several Live Images" 图标，以高亮显示所有预定义的观察区域。
   注意：该图标位于计算机屏幕顶部，外观为一个被分为四个小方格的方框。点击此图标后，所有预定义的观察区域将被高亮显示。
6. 关闭记录室的面板，然后在计算机显示器上点击 "Background | Start"。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48孔板	Fisher Scientific	08-772-52	幼年斑马鱼行为记录室
24孔板	VWR	10062-896	幼年胖头 minnow 行为记录室