光运动反应测定:一种测量斑马鱼幼鱼对照明条件突然变化的行为反应的方法

1. 视频跟踪参数校准

1. 在进行行为测量之前，在视频跟踪软件中设置观察和校准参数（参见材料表）。
   1. 在记录室中放置一个孔板，每个孔中至少有 1 条幼鱼。使用板和相关鱼作为表示来设置校准参数。
   2. 在视频轨道软件中，单击"文件 |Generate Protocol"，这将打开一个 "protocol creation wizard" 对话框。在"Location Count（位置计数）"字段中，输入孔板的单个孔数，然后单击"OK"（确定）。
   3. 在屏幕顶部，单击"View |Full Screen"，这将提示系统显示孔板的俯视摄像头视图。
   4. 单击"绘制区域"图标，该图标显示为三个多色形状。在孔板查看区域的右侧，选择标有"Areas"的字段中的圆圈图标。
   5. 使用光标在孔板的左上角孔中描绘圆形视频跟踪区域。选择"右上标记"，然后勾勒出右上井的查看区域。然后，选择 "Bottom Mark" 勾勒出右下角的轮廓。
      注意:绘制圆形轮廓后，可能需要调整其位置。要调整轮廓的位置，请单击"选择"，然后使用光标移动轮廓区域。此外，可以通过单击"复制"，然后单击"粘贴"来复制轮廓。
   6. 定义左上角、右上角和右下角的孔跟踪区域后，单击 "Build" 提示软件自动描绘其余孔的观察区域。
   7. 在标有"校准"的区域，单击"绘制比例"。使用光标在板上绘制一条水平线。绘制线条后，将出现一个标有"校准测量"的对话框。输入孔板长度，然后单击"确定"。
   8. 单击 "Draw Areas" 图标退出绘图管理器。
   9. 单击"平铺"图标。使用光标突出显示查看屏幕上出现的所有框，使每个框都是绿色的。
      注意:Tiles 图标显示为一组 6 个单独的小方块
   10. "单击 View|全屏"。在板观察区域右侧，单击标有"检测阈值"的框中的"Bkg"。使用阈值调整条设置像素检测阈值。选择适当的像素检测阈值后，单击"应用于组><"。 注意:该协议将斑马鱼观察的黑色模式下的检测阈值设置为 13，在透明模式下将检测阈值设置为 110，用于胖头鲦鱼观察。
   11. 在标有 "Movement Threshold" 的框中，输入所需的移动速度跟踪参数。设置速度参数后，单击"应用于组><"。 注意:此协议将小/大运动设置为 20 mm/s，将非活动/小运动设置为 5 mm/s。这些选择对软件进行编程，以跟踪幼鱼在三个不同速度水平上的运动:不活跃（冻结）= <5 mms，小（巡航）= "5-20" s，大（爆裂）="">20 mm/s。
   12. 点击"参数 |Protocol Parameters"下拉菜单中。在对话框中，选择 "Time" 选项卡。输入观测时间和积分时间。输入参数后，单击 "Ok"。
   13. 要设置每个光周期的亮/暗光周期时间和光照强度，请从"参数"下拉菜单中选择"Light Driving"，打开灯光驾驶员设置对话框><。 注意:有关设置多个明暗光周期的信息，请参阅协议视频。
   14. 设置视频跟踪参数后，保存观察协议。
       注意:该协议观察鱼在 50 分钟内的行为，其中包括 10 分钟的驯化阶段，然后是 4 个改变的亮/暗阶段，包括两个 10 分钟的光照期和两个 10 分钟的黑暗期。集成时间设置为测量 50 分钟行为试验中每分钟的行为。

2. 观察幼鱼的运动和光运动行为

1. 将含有实验鱼的孔板放入行为记录室中。
2. 在视频跟踪软件中，打开下一步开发的跟踪协议。
3. 在视频跟踪查看器中，检查以确保所有幼虫在计算机屏幕上都可见，每个孔中仅存在一个单独的幼虫，并且各个孔在步骤 1.1.5 和 1.1.6 中定义的观察区域内对齐。
4. 点击"实验 |执行".
   注意:系统将提示用户提供名称和位置以保存观测数据。
5. 指定观测数据的名称和保存位置后，单击"多个实时图像"图标以突出显示所有预定义的查看区域
   注意:此图标位于计算机屏幕的顶部，显示为一个分为四个较小方块的框。单击此图标将突出显示所有预定义的查看区域。
6. 关闭记录室的面板，然后单击"背景 |Start"。