捕食行为检测法：一种研究斑马鱼幼虫捕食行为的方法

摘要

来源：Muto, A.，等。利用双光子激光消融神经元群体并结合钙成像与斑马鱼幼鱼行为记录进行评估。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了捕食行为检测实验。视频讨论了在对特定神经元进行激光消融后，研究斑马鱼幼鱼捕食行为的方法。

方案

1. 激光消融后行为学后果的评估

1. 设置一个行为记录系统，该系统由配备视频相机的体视显微镜组成。使用具有适当图像采集软件的相机，可以是商用或定制的（图1A）。
2. 优化照明条件，以便通过图像处理检测paramecium。例如，使用带垫片的环形白色LED灯（图1B）。
   注意： LED灯与样品之间的距离和角度会影响样品的成像效果（即，暗背景中的亮像或亮背景中的暗像），因此对成功进行图像处理至关重要。需确定垫片的最佳高度（图1C）。
3. 将一条斑马鱼幼鱼（来自第1节所述的激光消融实验后恢复的个体）放入行为记录室（已固定在载玻片上），并移除原有的顶部密封（图1D）。
4. 使用微量移液器从烧杯中吸取悬浮在水中的50个paramecia，并将其放入记录室中。
5. 在记录室上方加盖盖玻片。在将盖玻片放置于记录室水面之前，先在其上滴加少量水，以避免将空气带入腔室。
   注意： 此步骤中，部分含有paramecia的水会从记录室溢出。记录室内剩余的paramecia数量约为30–40个。
6. 将含有幼鱼和paramecia的记录室置于照明系统中（图1D）。
7. 以10 fps的速度开始延时录像，持续11分钟（共6,600帧）。
8. （可选）对于每条用于行为测试的幼鱼，通过荧光显微镜观察激光消融区域的荧光情况，以确认激光消融的有效性（即，激光照射区域内荧光细胞缺失或数量显著减少）。
   注意： 即使经过照射，由于消融后新分化的细胞中Gal4基因表达的延迟出现，仍可能观察到一些荧光细胞。
9. 记录完幼鱼行为后，为补偿背景不均匀性，在Fiji中对每一帧图像进行逐像素除以平均图像的操作：点击“Process”（处理）、“Image Calculator”（图像计算器）、选择“Operation: Divide”（运算方式：除法）、勾选“32-bit(float) result”（32位浮点结果），然后点击“OK”（确定）。生成平均图像的方法为：点击“Image”（图像）、“Stacks”（堆栈）、“Z-Project”（Z轴投影）、选择“Average intensity”（平均强度），然后点击“OK”（确定）（图1E, F）。
10. 通过点击“Analyze”（分析）、“Analyze Particles”（分析颗粒），设置覆盖所有paramecia的面积范围，勾选“Show: Masks”（显示：掩膜）复选框，然后点击“OK”（确定），来统计记录室中剩余的paramecia数量。“Show: Masks”选项将生成提取出的paramecia图像（图1G），并列出每帧图像中颗粒（paramecia）的数量。
11. 绘制记录室中剩余paramecia数量随时间变化的曲线图。由于对paramecia数量的估计存在噪声，建议在电子表格中对每个数据点进行600帧（1分钟）范围内的移动平均处理。

结果

图1. 激光消融斑马鱼幼鱼中的猎物捕食实验及代表性数据。 (A) 行为记录系统。体视显微镜配备了一个CMOS相机。图像通过自编脚本进行采集。(B) 照明系统的组成部分。包括灰色纸张、玻璃漫射器、白色LED环形灯、漫射器、自制隔片（纸板）以及中心带孔的漫射器。(C) 由B中所示部件组装而成的照明系统。(D) 猎物捕食实验的记录腔室。将一个腔室（直径：20 mm；深度：2.5 mm）置于载玻片上。腔室原有的顶部密封膜已被剥离。在记录腔室上加盖盖玻片。(E) 视频某一帧的原始图像。(F

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成像室	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	用作行为记录室
ORCA-Flash4.0 	Hamamatsu Photonics	型号：C11440-22CU 	科学级CMOS相机
SZX7	Olympus		体视显微镜
环形LED光源	CCS  	型号：LDR2-100SW2-LA	白色LED
Secure-Seal杂交室垫圈，8孔，直径9 mm × 深度0.8 mm	Molecular Probes	目录号：S-24732	用于钙成像中的记录室