明暗偏好测试：一种研究斑马鱼焦虑相关行为的方法

摘要

来源：Holcombe, A.，等。一种向多条斑马鱼（Danio rerio）给药及量化戒断反应的新方法。J. Vis. Exp. (2014)

该视频介绍了明暗偏好实验，用于研究斑马鱼在接触乙醇后与焦虑相关的行为。

方案

1. 行为学测试

1. 获取一个宽9.5 cm、长55 cm、深9.5 cm的明暗穿梭箱，底部为白色防水材质（图1B）。使用魔术贴将白色和黑色防水无反光纸固定在穿梭箱内壁，使箱体一半区域覆盖白色，另一半覆盖黑色。加入栖息环境水至水深5 cm，水温维持在25–28 °C，并在整个实验过程中保持该温度。
2. 通过构建一个三面白色的围挡结构，将穿梭箱置于其中，以尽量减少外部视觉刺激。确保测试区域具有均匀的顶部漫射光源，避免水面产生反光，同时保证光照强度足以支持运动追踪软件运行，或便于后续通过视频图像进行人工手动定量分析。
3. 将穿梭箱放入围挡结构中，并设置行为追踪软件的录像与运动分析参数。根据研究问题设定实验时长为5–15分钟。
   注意：本文中采用5分钟。
4. 将待测鱼群连同其栖息水箱一起转移至实验区域，并放置在穿梭箱围挡外。使鱼群适应环境10分钟。
5. 从相应组别中轻轻用网捞出一条鱼，将其置于明暗穿梭箱的中央位置，释放时确保鱼体方向与穿梭箱长轴平行，以避免人为诱导其偏向明亮区或黑暗区。
6. 在释放动物后立即开始记录行为。密切观察软件是否出现追踪异常，或鱼是否出现跳跃、僵直等异常行为。在完成一半受试个体测试后，将穿梭箱旋转180°，以消除因穿梭箱某一端朝向围挡开放端所可能导致的方向偏好干扰。
7. 实验结束后，轻轻用网捞出鱼并从穿梭箱中移除，转移至暂养水箱或原栖息水箱中。

2. 分析

1. 分析在明区与暗区所花费的时间。针对每组中的每条鱼，获取其在明区和暗区所花费的相对时间，并使用单样本t检验（或对非参数数据采用Wilcoxon符号秩检验；与总实验时间的一半即150秒进行比较），以确定各组是否显著偏好某一区域。
2. 为比较偏好性，通过从暗区停留时间中减去明区停留时间来计算偏好指数，并比较各组间的差异。t检验可用于比较两组。当比较多个组时，应根据需要采用单因素方差分析并结合Tukey’s HSD事后检验（或对非参数数据采用Kruskal-Wallis检验并结合Dunn’s多重比较事后检验）。
3. 比较各组间的运动速度、区域转换次数、蜿蜒程度及静止不动时间。根据需要采用单因素方差分析并结合Tukey’s HSD事后检验（或对非参数数据采用Kruskal-Wallis检验并结合Dunn’s多重比较事后检验）。

结果

图1：转移流程与明/暗实验箱示意图。这些照片展示了转移操作的流程。（A） 首先，将鱼类置于转移缸中（左图）；右侧为含有乙醇的给药缸。（B-C） 将鱼类从转移缸转移至乙醇溶液时，研究人员需将产卵插板从转移缸中提起，并移入乙醇溶液缸中。（D） 所示的明/暗实验箱尺寸为宽9.5 cm、深9.5 cm、长55 cm。实验箱底部为白色，其中一半区域（左侧）侧壁为黑色，另一半侧壁为白色，从而形成明区与暗区。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明暗实验箱 	定制		根据操作步骤描述构建。宽9.5 cm，深9.5 cm，长55 cm。
三层搁板式台式饲养系统	Aquatic Habitats	不适用
1.5 L 产卵缸，配备400 μm 挡板	Aquatic Habitats	不适用
Ethovision XT 运动轨迹追踪软件	Noldus Information Technology
纯谷物乙醇	Luxco, INC 	不适用