基于胚胎的化学毒性屏幕：评估对斑马鱼胚胎发育的影响

Abstract

资料来源：浩J 等人， 大型斑马鱼基在体内小分子屏幕。 J. 维斯 (2010)

在本文中，斑马鱼胚胎用于化学毒性筛查。化学毒性与表型读数相关。样本协议显示了执行化学毒性筛查的方法论方法。

Protocol

1. 小分子库的转移

虽然复合转移可以通过机器人传输方法实现自动化，但我们将描述手动转移方法。

1. 小分子库通常以 96 井格式提供，每个化合物都存储在 DMSO 中，作为 10 mM 库存。在胚胎到达添加化合物的阶段前约60分钟，解冻了96个含有小分子（源板）的96个井板。注意源板的序列号或其他标识号。为了尽量减少板块上的凝结，解冻可能发生在含有德里石的干燥室（W.A.哈蒙德德里埃里特公司，Xenia，OH）。
2. 在装有多井板适配器的桌面离心机中短暂地旋转板。
3. 从源板中取出铝密封胶带。使用 12 通道移液器，将源板中的化合物稀释到 0.5 mM 的浓度（例如，如果从 250 nL 的 1000 万立方米库存开始，则向每口井添加 4.75 μL 的 DMSO）。
4. 当96井板（受体板）中的胚胎达到预期阶段时，使用12通道（2-20 μL）移液器将2.5μL化合物（0.5mM）从源板转移到含有胚胎的受体板中。
5. 记录接受者胚胎板上来源板的识别编号。将现在含有胚胎和化合物的受体板盖上盖子，轻轻旋转将板混合，并将其放置在 28.5°C 的孵化器中。
6. 用铝密封胶带盖住每个含有未使用小分子（0.5 mM）的源板，并放置在 -80°C 的冰柜中，以进行长期存储。

2. 通过对表型的视觉检查对小分子的影响进行筛查

1. 在执行屏幕之前，为构成"命中"的内容制定具体标准。
2. 在发育的理想时间，从孵化器中取出含有复合处理胚胎的96井板，并在立体显微镜下检查每个井。为了更好地可视化细微的变化，如循环模式的变化，可以使用相位对比倒显微镜。荧光显微镜可用于检查特定组织促进剂下 GFP 或 DsRed 蛋白质表达的扰动。
3. 快速扫描96井板的任何井，其中至少3出5个胚胎显示规定的"命中"表型。记录板的标识和每个潜在命中的井位置。
4. 通过在几剂（1 uM、5 uM、10 μM 和 50 μM）中重新测试化合物的效果，再次确认潜在的打击。每剂量，10个胚胎以48个井板格式在0.5 mL的E3介质中测试。复检的复合添加时间应与原始筛选的时间相同。当在复检化合物时复制引出的表型时，会确认一击
5. 从化学库中小分子数据库中识别命中化合物。

Materials