基于胚胎的化学毒性筛选：评估对发育中斑马鱼胚胎的影响

摘要

来源：Hao J. 等，基于斑马鱼的大规模体内小分子筛选。J. Vis. Exp. (2010)

本文使用斑马鱼胚胎进行化学毒性筛选。化学毒性与表型读数相关。示例方案展示了开展化学毒性筛选的方法学途径。

方案

1. 小分子文库的转移

尽管化合物转移可通过机器人转移方法实现自动化，但本文将描述手动转移方法。

1. 小分子文库通常以96孔板形式提供，每种化合物以10 mM的储备液形式溶于DMSO中。在胚胎达到需要添加化合物的发育阶段前约60分钟，取出含有小分子分装液（来源板）的所需数量的96孔板进行解冻。记录来源板的序列号或其他识别编号。为尽量减少板上产生冷凝，可在含有干燥剂（Drierite，W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH）的干燥箱中进行解冻。
2. 使用配备多孔板适配器的台式离心机对板进行短暂离心。
3. 移除来源板上的铝密封膜。使用12通道移液器，将来源板中的化合物稀释至0.5 mM的浓度（例如，若起始为10 mM储备液的250 nL分装量，则向每孔加入4.75 μL DMSO）。
4. 当96孔板中的胚胎（受体板）达到目标发育阶段时，使用12通道（2–20 μL）移液器将2.5 μL的化合物溶液（0.5 mM）从来源板转移至含有胚胎的受体板中。
5. 在受体胚胎板上记录来源板的识别编号。用盖子盖好现已含有胚胎和化合物的受体板，轻轻晃动混匀，并将其置于28.5°C培养箱中孵育。
6. 用铝密封膜封好每块含有未使用小分子（0.5 mM）的来源板，并置于-80°C冰箱中长期保存。

2. 通过表型的视觉观察筛选小分子的作用效果

1. 在进行筛选之前，需制定明确的标准，以界定何种结果可被视为有效 "击中".
2. 在发育的预定时间点，从培养箱中取出含有化合物处理胚胎的96孔板，在体视显微镜下逐孔观察。为更清晰地观察细微变化（如循环模式的改变），可使用相差倒置显微镜。若需检测在组织特异性启动子驱动下GFP或DsRed蛋白表达的扰动情况，可采用荧光显微镜进行观察。
3. 快速扫描96孔板，找出其中至少有5个胚胎中3个表现出规定表型的孔 "击中" 表型。记录每个潜在阳性孔所在的培养板编号及其孔位。
4. 通过在多个剂量（1 μM、5 μM、10 μM 和 50 μM）下重新检测化合物的作用，以验证潜在的阳性结果。每个剂量组在48孔板中以0.5 mL E3培养基处理10个胚胎。重新测试时化合物的添加时间应与原始筛选条件完全相同。当化合物在重复测试中再现所诱导的表型时，即可确认为阳性结果。
5. 从化学文库的小分子数据库中鉴定出命中化合物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
以 DMSO 为溶剂、浓度为 10 mM 的结构多样化小分子化合物库，以 96 孔板格式排列。每块主板分装至 96 孔聚丙烯储存板（Corning）中，并于 -80°C 保存°C直至 使用。
Drierite	W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH
12通道移液器，2-20 μL μL	Eppendorf
96孔板用铝封膜	Nunc，罗切斯特，纽约州
DMSO	Sigma，美国密苏里州圣路易斯
基础培养箱，28.5°C	Fisher Scientific
聚苯乙烯96孔圆底检测板	Corning COSTAR；洛威尔，马萨诸塞州
带透射光源底座的体视显微镜	Leica Microsystems，Bannockburn，IL
E3 胚胎培养基：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4，含 0.003% PTU（苯硫脲，Sigma；St. Louis, MO）。			PTU 可配制成 10 倍浓度溶液，方法是将 0.3 g PTU 溶解于 1 L E3 胚胎培养基中。含 PTU 的溶液应避光保存，可用铝箔包裹。