靶向肝脏消融：利用甲硝唑在转基因斑马鱼幼虫中诱导肝细胞死亡

摘要

来源：Choi T.Y.，等。利用斑马鱼肝细胞特异性消融研究胆管驱动的肝脏再生。J. Vis. Exp. (2015)

本文介绍了一种在转基因斑马鱼幼鱼中利用甲硝唑诱导肝细胞死亡的靶向性肝脏消融方法。示例实验方案详细描述了在斑马鱼中建立、操作和评估靶向性肝脏消融的过程。

方案

1. 胚胎/幼虫的制备

1. 将100个胚胎转移至含有25 ml 胚胎培养液的100 mm 培养皿中。每个培养皿中培养的胚胎数量不超过100个，并在28 °C条件下培养。
2. 为抑制色素形成，在受精后10小时（hpf）之前向培养皿中加入苯硫脲（PTU），并将胚胎/幼鱼培养至80 hpf。PTU的终浓度为0.2 mM。
   注意：PTU具有毒性，请依照适当的操作规范使用。
3. 通过向培养皿中加入终浓度为0.016%的3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）对幼鱼进行麻醉。然后使用落射荧光显微镜筛选CFP阳性幼鱼。选择肝脏大小相近的幼鱼，剔除肝脏过小或过大的个体。
   注意：任何CFP阳性的幼鱼均可使用，无论其荧光强度如何，因为杂合子与纯合子幼鱼在肝细胞消融程度上无差异。
   注意：Tricaine具有毒性，请依照适当的操作规范使用。
4. 移除含有Tricaine的胚胎培养液，更换为添加了0.2 mM PTU的胚胎培养液。将胚胎/幼鱼继续在28 °C条件下培养。

2. Mtz 处理

1. 通过将 0.171 g 甲硝唑（Mtz）粉末溶解于 100 ml 含 0.2% DMSO 和 0.2 mM PTU 的蛋水中，配制新鲜的 10 mM Mtz 溶液。为完全溶解 Mtz，于室温下混匀该溶液 持续搅拌20–30分钟。为促进甲硝唑（Mtz）溶解并增强其向幼虫体内的渗透，在配制Mtz时加入DMSO。
   警告：长时间暴露或高浓度的Mtz具有毒性，应按照适当的处理指南使用。
2. 将幼虫按实验需求数量分别转移至两个不同的100 mm培养皿中，分为对照组和实验组 mm 培养皿或多孔板。实验组幼虫置于 10 mM Mtz 溶液中，对照组幼虫置于含 0.2% DMSO 的卵水中。
3. 用铝箔覆盖含有Mtz溶液的培养板或培养皿，以防止Mtz发生光失活，并在28 °C下孵育。Mtz处理的持续时间取决于幼虫发育阶段和转基因品系。

3. 胆汁驱动的肝脏再生分析

1. 在消融期结束时，从培养皿中移除甲硝唑（Mtz）溶液。加入25 ml卵水清洗经甲硝唑处理的幼鱼。轻轻晃动培养皿2-3次以清洗幼鱼，然后弃去卵水。重复此清洗步骤三次，最后再将幼鱼浸入卵水中一次。为避免甲硝唑处理的幼鱼出现心脏水肿及死亡，使用较低浓度的三卡因（Tricaine），终浓度为0.008%，以固定幼鱼。
2. 进行肝脏分析时，在落射荧光显微镜下使用CFP滤光片观察经甲硝唑处理的幼鱼肝脏大小。根据相对肝脏大小评估肝细胞消融程度：大（未消融；0-10%幼鱼）、中等（部分消融；10-20%）、极小（完全消融；80-90%）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）粉末	Sigma-Aldrich	A5040	配制 0.4%（15 mM）Tricaine 储存液：将 0.4 g Tricaine 溶于 100 mL 卵水（egg water）中，调节 pH 至 7。
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
甲硝唑	Sigma-Aldrich	M1547
N-苯硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich	P7629
100 × 15 mm 培养皿	Denville Scientific Inc.	M5300
卵水（egg water）			在蒸馏水中加入 0.3 g/L 海盐 ‘Instant Ocean’ 和 0.5 mM CaSO₄。
落射荧光显微镜	Leica Microsystems	M205FA