吗啉代注射：一种在斑马鱼中敲低目标基因表达以研究其功能的方法

摘要

来源：Hyde D.R.， 等 体内 成年斑马鱼尾鳍再生过程中吗啉代寡核苷酸的电穿孔导入. 视频实验杂志 (2012)

本方案通过在斑马鱼尾部注射吗啉代寡核苷酸，实现对基因表达的靶向敲低。

方案

1. 形态学注射

1. 注射吗啉代寡核苷酸前一天，制备注射板（图1）。确保在井的一端切出一个缺口，有助于在显微注射过程中稳定斑马鱼。
2. 将荧光素标记的吗啉代寡核苷酸稀释至适当浓度（建议起始浓度为 1.2 mM），置于 65 °C 水浴中孵育 5 分钟。
3. 用吗啉代寡核苷酸溶液填充注射针（注意：根据是采用后向填充还是前向装填的方式，决定先填充针头还是先切割针尖）。
4. 以一定角度剪去针尖。
5. 按照显微注射系统的操作说明，每次注射注入约 5 nl 的吗啉代寡核苷酸液滴。注射体积过大可能破坏组织。
6. 将鱼麻醉后置于注射板上，去除多余液体，并将针头定位至适当位置，位于骨性鳍条远端附近（图2）。使用适用于吗啉代寡核苷酸注射的显微镜和显微注射装置（见试剂一览表），从腹侧向背侧方向将吗啉代寡核苷酸注入鳍组织，如 图2 所示。若从背侧向腹侧注射，会导致鳍组织在注射过程中卷曲，操作极为困难。
7. 轻柔地将针头插入再生组织，位于每根骨性鳍条远端稍后处（图2 中标记为 "1" 的位置），并向远端推进，直至进入芽基区域（图2 中标记为 "2" 的位置）。注意不要将针头完全穿透整个鳍。当针头准确定位后，注射吗啉代寡核苷酸（即点击一次）。在 1.2 mM 浓度下，荧光素标记的吗啉代寡核苷酸溶液在普通光线下呈黄绿色。每次注射时均可观察到黄色的"喷雾状"溶液扩散，有助于确认注射位置是否准确位于芽基。每根骨性鳍条应注射约 75 nl（10–15 次点击）吗啉代寡核苷酸溶液。每次点击间隔约 1 秒。我们仅对背侧进行注射，腹侧则作为仅进行电穿孔的对照。

结果

图1. A. 注射板的示意图，该板由琼脂糖制成，包含一个小孔，用于在对斑马鱼进行吗啉代显微注射时固定鱼体。

图 2. 吗啉寡核苷酸显微注射示意图。A. 将鱼置于培养皿中，鱼头置于孔洞切口处，有助于固定鱼体，保持稳定。B. 在低倍镜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吗啉代寡核苷酸 	GeneTools, LLC 		Morpholino 应根据您感兴趣的蛋白质进行定制设计
微量注射泵 	World Precision Instruments, Inc. 	PV830 	气动PicoPump 可使用多种不同的显微注射系统
显微操作仪 	World Precision Instruments, Inc. 	MMJR 	右手型（左利手为 MMJL）
显微注射针，外径1.0 mm 	World Precision Instruments, Inc. 	1B100F-4 	这些是拉制成针状的硼硅酸盐玻璃毛细管
持针器 	世界精密仪器公司 	5430-ALL 	Pico喷嘴套件；确保插入1.0 mm移液器密封圈
针头拉拔器 	Sutter Instrument Co. 	P-97 	其他微量移液器/针头拉制仪也应可用
显微镜 	徕卡、尼康、蔡司 	数量因制造商而异 	任何配备20倍光学镜头并可配合显微操作器使用的体视显微镜
2-苯氧乙醇 	Sigma-Aldrich 	77861-1L 	麻醉；用于实验操作时，按1:1000比例稀释于养鱼系统水中，安乐死时按1:500比例稀释