交配与卵子分期：一种按发育阶段生成并分选胚胎的方法

摘要

来源：Hostelley T.L.，等。利用RNA测序分析斑马鱼基因表达数据的样品制备与分析。J. Vis. Exp. (2017)

本文介绍了一种通过自然交配产生斑马鱼胚胎并对其发育阶段进行分选的实验方案。该方案进一步用于利用转基因鱼分析胰腺β细胞。

方案

1. 通过自然交配产生胚胎

1. 将胚胎培养至3个月龄，达到性成熟。
2. 在收集胚胎前一晚，将所需品系的成年雄鱼和雌鱼分隔放入分隔式交配缸中，每缸放入2条雄鱼和3条雌鱼。
   注意：使用转基因 insulin2a:mCherry 荧光报告品系可实现对胰腺β细胞的分析。
3. 次日早晨开灯后，将鱼转移至交配缸并用新鲜系统水冲洗，随即移除隔板。
4. 让鱼自然交配，直至在缸底观察到胚胎。每30分钟收集一次胚胎，直至获得所需数量。将每次收集的胚胎按时间点分别置于含胚胎培养基的培养皿中，在28.5 °C下培养。
5. 如需进行遗传物质显微注射或转入实验性培养基中处理，可执行相应操作，并将胚胎在新鲜的Hank's胚胎培养基 中，于10 cm培养皿内、28.5 °C条件下继续培养。
   注意：对于注射吗啉代（MO）或突变体动物的基因表达分析，需注意每种操作可能对基因表达产生非特异性影响。突变体可能在转录水平上出现基因补偿效应，而基于MO的基因靶向则通常不表现出该现象。

2. 胚胎分期

1. 将胚胎以每10 cm培养皿 50–75枚胚胎 的密度分组培养，以促进所有胚胎发育时相的一致性。
2. 在卵裂期、外包期和体节期使用解剖显微镜监测胚胎的形态发育。
   注意：及时移除死亡或畸形的胚胎，以防止培养皿中其他胚胎的发育延迟。
3. 根据胚胎的发育年龄进行分离。在受精后24小时（24 hpf）依据总体长对胚胎和幼鱼进行分期。
   注意：体节是位于胚胎背部、呈V形的中胚层组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
1.0升交配缸套装	Aquaneering	ZHCT100
体视显微镜	Zeiss