交配和卵子分期:一种生成胚胎并按发育阶段对胚胎进行分类的方法

Abstract

来源:Hostelley T.L. 等人。 斑马鱼基于 RNASeq 的基因表达数据的样品制备和分析。J. Vis. Exp. （2017 年）

文章描述了一种通过自然交配和对斑马鱼发育阶段进行分类来产生斑马鱼胚胎的方案。该方案进一步用于使用转基因鱼分析胰腺β细胞。

Protocol

1. 通过自然交配产生胚胎

1. 培养胚胎至 3 个月大，生殖成熟。
2. 在胚胎收集前一天晚上，将所需品系的成年雄鱼和雌鱼分离到分开的交配池中，并在每个鱼缸中增加 2 条雄鱼和 3 条雌鱼><。 注:使用转基因胰岛素 2a:mCherry 荧光报告菌株可以分析胰腺 β 细胞。
3. 用新鲜的系统水将鱼转移到交配池，并在第二天早上灯亮起后立即取下隔板。
4. 让鱼自然交配，直到在底部水箱中观察到胚胎。每隔 30 分钟收集胚胎，直到收集到所需的量。将每个收集的时间点储存在胚胎培养基中于28.5°C的单独培养皿中。
5. 如果需要，进行遗传物质的显微注射或放置在实验培养基中，并在 28.5 °C 的 10 厘米培养皿中的新鲜汉克胚胎培养基中培养胚胎
   注:对于吗啉代 （MO） 注射或突变动物的基因表达分析，请注意，每次作都可能对基因表达产生偶然影响。突变体可以在基于 MO 的基因靶向未观察到的转录水平上表现出遗传补偿。

2. 胚胎分期

以
1. 每 50 厘米培养皿 75-10 个胚胎为一组培养胚胎，以促进所有胚胎的一致发育时间。
2. 在卵裂球、表皮和体节阶段使用解剖显微镜监测发育形态，以确保发育进展><。 注意:去除任何垂死或畸形的胚胎，以防止培养皿发育迟缓。
3. 根据发育年龄将胚胎分开。使用 24 hpf 后的全身长度对胚胎和幼虫进行分期
   注意:体节是存在于胚胎背面的 V 形中胚层组织。

Materials