从尾鳍组织提取DNA：斑马鱼基因分型中常用的方法

摘要

来源：Xing L.，等。利用高分辨率熔解分析进行快速高效的斑马鱼基因分型。J. Vis. Exp. (2014)。

本文介绍了从斑马鱼尾鳍组织中提取DNA的方法。该方案展示了一种快速且高效的斑马鱼基因型分析技术。

方案

1. DNA 制备

1. 配制DNA裂解缓冲液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、0.3% Tween 20、0.3% NP40。在使用当天，加入新鲜的蛋白酶K，使其终浓度为1 mg/ml。
2. 组织采集：
   1. 成年鱼尾鳍取样：
      1. 麻醉鱼类：将鱼放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，等待鳃部运动减缓。
      2. 将鱼置于5–10层Kimwipe纸巾上，用无菌剃刀片切取一小段尾鳍组织，大小约为2–3 mm。
      3. 迅速将鱼转移至装有新鲜水的已标记鱼缸中恢复；同时仔细标记鱼缸及对应存放尾鳍组织的离心管。每隔一天更换水并喂食。
      4. 用无菌移液器吸头拾取尾鳍组织，转移至含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。
      5. 丢弃移液器吸头，并将剃刀片放入锐器容器中。
   2. 胚胎尾部取样：
      1. 将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。
      2. 在体视显微镜下用镊子剪取尾部组织片段。
      3. 将尾部组织放入含有30 μl DNA裂解缓冲液的已标记离心管中。
      4. 迅速将胚胎放入含有100 μl 4%多聚甲醛的离心管中。
      5. 标记含有胚胎的管子及其对应的尾部组织管。
      6. 将含有胚胎的管子在4 °C下过夜保存，以完成固定。
      7. 每次处理不同胚胎之间，使用Milli-Q水和Kimwipe纸巾清洁镊子，以最大限度减少污染。
   3. 整胚取样：
      1. 将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。
      2. 将1–5个胚胎放入含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。无需去壳。
3. DNA消化
   将含有组织（尾鳍或尾部组织片段或胚胎）的离心管在55 °C孵育4小时至过夜。
4. 灭活蛋白酶K
   将离心管在95 °C加热15分钟。所得DNA应立即用于PCR，或在-20 °C保存不超过3个月。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 次反应 LightScanner 预混液	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
三卡因
多聚甲醛