光片显微镜样品制备：活体斑马鱼胚胎的长期成像固定方法

摘要

来源：Icha J.，等。利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼部发育。J. Vis. Exp. (2016)。

本文介绍了光片荧光显微镜的样品制备方法，并演示了一种用于长期成像的活体斑马鱼胚胎安装技术，该方法可在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间延时摄影记录。

方案

1. 样品制备

1. 准备琼脂糖混合液
   1. 在配制琼脂糖混合液前15分钟，将1 ml 1%低熔点琼脂糖（溶于E3培养基中）置于70 °C的加热块中融化。琼脂糖完全融化后，取600 µl转移至新的1.5 ml离心管中，加入250 µl E3培养基、50 µl 0.4% MS-222和25 µl充分涡旋混匀的珠子储备液。
      注意：此配比共得925 µl混合液，另预留75 µl用于后续与胚胎一同加入的液体。
   2. 将离心管置于另一设定为38–40 °C的加热块中，或确保琼脂糖温度接近其凝胶化临界点，再将胚胎样品加入其中。
2. 固定胚胎
   1. 取五根20 µl容积的玻璃毛细管（带黑色标记，内径约1 mm），将匹配的聚四氟乙烯（Teflon）推杆插入毛细管中。推动推杆使其聚四氟乙烯尖端位于毛细管底部。
   2. 用玻璃或塑料移液器将五个胚胎（可一次性固定的数量）转移至盛有37 °C温热琼脂糖混合液的离心管中。
      注意：尽量减少随胚胎转移的液体体积。
   3. 将毛细管插入混合液中，通过上拉推杆吸取一个胚胎进入毛细管。确保胚胎头部先于尾部进入毛细管，避免推杆与样品之间产生气泡。胚胎上方应保留约±2 cm的琼脂糖，下方保留约±1 cm。对剩余胚胎重复此操作。
   4. 等待琼脂糖完全凝固（数分钟内即可完成），随后将样品置于E3培养基中，用橡皮泥或胶带将毛细管固定在烧杯壁上。毛细管底端应悬于溶液中，以保证样品的气体交换。
      注意：第1.1和1.2节所述类似实验方案亦可见于OpenSPIM维基页面 http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation。

2. 样品定位

1. 样品架组装
   1. 将两个合适尺寸（黑色）的塑料套管相对插入样品架杆中，使其切口朝外。将夹紧螺钉轻轻旋入2-3圈。将毛细管穿过夹紧螺钉，并推入样品架，直至黑色色带在另一侧可见。避免触碰推杆。
   2. 拧紧夹紧螺钉。将胚胎下方多余的约1 cm琼脂糖从毛细管中推出并切除。将杆部插入样品架圆盘中。
   3. 在软件中确认显微镜载物台处于装载位置。利用导轨将整个带样品的样品架垂直向下滑入显微镜。旋转样品架，使磁性样品架圆盘锁定到位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lightsheet Z.1 显微镜	Carl Zeiss Microscopy
低熔点琼脂糖	Roth	6351.1
低熔点琼脂糖	Sigma	A4018 或 A9414
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MESAB/MS-222/Tricaine）	Sigma	E10521
20 μl（内径 1 mm，黑色标记）毛细管	Brand	701904	作为移液器配件出售
20 μl 毛细管用聚四氟乙烯尖端活塞	Brand	701932	作为移液器配件出售