光片显微镜样品制备：安装活斑马鱼胚胎进行长期成像

Abstract

资料来源：Icha J.等人利用光片荧光显微镜对斑马鱼眼发育进行成像。J. 维斯. 博览会.(2016).

本文描述了光片荧光显微镜的样品制备情况。它还演示了一种安装活斑马鱼胚胎进行长期成像的方法，这种方法允许记录在近生理条件下活体胚胎的长期延时电影。

Protocol

1. 样品准备

1. 准备阿加罗斯混合
   1. 在制作 agarose 混合物前 15 分钟，将 1% 低熔点 agarose 的 1 毫升阿加罗斯（溶解在 E3 中等）的加热块中熔化为 70 °C。 一旦阿加罗斯完全熔融，将 600 μl 转移到新鲜的 1.5 毫升管中，加入 250 μl 的 E3 介质、50 μl 的 0.4% MS-222 和 25 μl 的漩涡珠汤溶液。
      注： 这使得 925 μl 的混合物，而额外的 75 μl 计算的液体添加后与胚胎。
   2. 将管子保持在第二个加热块中，达到 38-40 °C，或在将样本胚胎放入管中之前确保血管非常接近其凝胶点。
2. 安装胚胎
   1. 取5个20μl体积的玻璃毛细（带有黑色标记，内径约1毫米），并将匹配的特氟隆尖柱塞插入其中。将柱塞推过毛细金石，使特氟隆尖位于毛细金石的底部。
   2. 将五个胚胎（一个可以同时安装的数字）与玻璃或塑料移液器转移到漩涡37°C暖糖混合管。
      注： 尝试与胚胎一起携带最小体积的液体。
   3. 将毛细金插入混合物中，通过将柱塞拉起吸入其中一个胚胎。确保胚胎的头部在尾部前进入毛细。避免柱塞和样品之间的任何气泡。胚胎上方应有±2厘米的糖，下方应有±1厘米。对剩余的胚胎重复上述步骤。
   4. 等到阿加罗斯完全凝固，在几分钟内发生，然后存储样品在E3介质，通过坚持他们用塑料或胶带烧杯的墙壁。毛细金的底部开口应免费悬挂在溶液中，以便将气体交换到样品中。
      注：在"开放SPIM"维基页面上也可以找到与第1.1节和第1.2节类似的协议，http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation。

2. 样品定位

1. 样本持有人组件
   1. 将 2 个大小合适的塑料套（黑色）相互插入样品支架茎中。他们的狭缝侧面必须朝外看。将夹子螺钉松动，将其转动 2-3 发。将毛细管插入夹紧螺丝，并将其推过支架，直到另一侧的黑色带可见。避免触摸柱塞。
   2. 拧紧夹子螺丝。将胚胎下方多余的1厘米的糖从毛细细骨中推出并切开。将茎插入样品支架盘中。
   3. 在软件中确认显微镜阶段处于负载位置。使用导轨将整个支架滑动，样品垂直向下滑入显微镜中。转动它，使磁性支架光盘锁定到位。

Materials