分层琼脂糖封片法：为使用倒置显微镜进行长期成像制备活体斑马鱼胚胎 关键词：斑马鱼胚胎，活体成像，倒置显微镜，琼脂糖封片，长期观察，显微操作

摘要

来源：Upadhyay S.，等。一种用于斑马鱼全胚胎长时间延时共聚焦显微成像的分层封片方法。J. Vis. Exp. (2020)。

本文介绍了一种用于长期成像的活体斑马鱼胚胎固定方法。该方法成本低廉，操作简便，可使用常规的玻璃底培养皿在倒置显微镜下进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。

方案

1. 胚胎的制备

1. 交配后，在培养皿的E3培养基中收集胚胎，并在26.5 °C下孵育约28小时，然后进行装片。
   注意：这可以减缓胚胎发育，使胚胎在成像开始时大致处于30体节期。
2. 用含0.016–0.020% 三卡因（Tricaine）的E3培养基麻醉胚胎。为抑制色素形成，加入PTU至终浓度200 µM。
3. 在解剖显微镜下用镊子去除胚胎的绒毛膜。使用两把镊子夹住绒毛膜并轻轻拉开，以释放胚胎。

2. 琼脂糖包埋

注意：所开发的固定方法需要两种不同浓度的低熔点琼脂糖，溶于含0.02%三卡因和PTU（视需要添加）的E3溶液中。第一种琼脂糖溶液包含最佳浓度的琼脂糖，以使变形和运动性降至最低。该优化过程见下文步骤5。

1. 将两层琼脂糖溶液（浓度见下文步骤5定义及1%）加热至65 °C。在固定胚胎前，让琼脂糖冷却至约30 °C，以避免高温损伤胚胎。固定时使用35 mm玻璃底培养皿，底部为No. 0盖玻片。附着在皿底的盖玻片形成一个10 mm浅（约1.2 mm深）的井状结构，胚胎将被放置其中。
   注意： 在本实验中，运动性最低且形变最小的琼脂糖浓度范围为0.025%至0.040%。
2. 使用玻璃移液管或微量移液器，将去壳的胚胎轻轻放置于培养皿底部，使其一侧朝下。若使用微量移液器，可剪去吸头外端以增大开口，便于容纳胚胎（图1A）。用微量移液器小心吸除残留的E3培养液。
3. 将第一层琼脂糖溶液加入由皿底盖玻片形成的浅井中，使其覆盖胚胎（第一层）（图1B）。确保琼脂糖完全覆盖浅井但不溢出。
4. 用一片盖玻片（22 mm × 22 mm）覆盖该浅井（图1C），从而在两片盖玻片之间形成一个狭窄的、充满琼脂糖的空间，胚胎位于其中。
5. 在整个培养皿底部的盖玻片上方覆盖一层1%琼脂糖溶液（第二层）（图1D）。此层凝固后可固定住上方的盖玻片。
6. 向培养皿剩余空间加入含0.02%三卡因的E3溶液，以保持系统湿润（第三层）（图1E）。
   注意： 在该装置中，盖玻片和1%琼脂糖层可防止底层琼脂糖被稀释。

3. 第一层琼脂糖溶液的优化

1. 为确定第一层琼脂糖的最佳浓度，采用多尺度网格搜索法。将胚胎以浓度递增的琼脂糖（范围从0.01%至1%）进行封片，随后对视野中胚胎的生长受限情况和运动性进行延时成像。找出使形变和运动性均达到最小的琼脂糖浓度。
2. 为进一步优化琼脂糖浓度，根据步骤3.1中确定的最佳浓度（例如0.025%、0.028%、0.031%等），使用更精细梯度的琼脂糖浓度（如0.025%至0.040%之间）对胚胎进行封片。
   注意： 在本实验室中，最佳琼脂糖浓度约为0.03%。

结果

图1：包埋方法说明。 （A）将斑马鱼胚胎加入35 mm培养皿中由玻璃底形成的微孔内。（B）向微孔中加入第一层琼脂糖以覆盖胚胎。（C）小心地将盖玻片置于微孔上方。（D）在35 mm培养皿的整个底部加入第二层琼脂糖。（E）向培养皿中加入E3培养基。（F）包埋装置横截面的示意图。（G）最终组装后斑马鱼胚胎的显微镜图像（5倍物镜）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich, MO	A9414	将溶解后的溶液储存于 4 °C
35 mm 玻璃底培养皿，带 0 号盖玻片，玻璃底直径为 10 mm	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
三卡因（MS-222）	Sigma-Aldrich, MO	E10521	将溶解后的溶液储存于 4 °C
N-苯硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich, MO	P7629	将溶解后的溶液储存于 -20 °C
DMC4500 数码显微镜相机	Leica	NA
显微盖玻片 22x22 mm  	VWR	48366 067