琼脂糖包埋：一种用于斑马鱼胚胎长期成像的活体封片基本方法

摘要

来源：Hagedorn E. J.，等。通过手术融合发育中的囊胚生成共生斑马鱼胚胎。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频详细介绍了使用低熔点琼脂糖将活体斑马鱼胚胎固定在6孔板上的逐步操作步骤，同时提供了活体胚胎的成像方法以及利用软件进行图像分析的流程。

方案

1. 显微镜设置、图像采集、处理与分析

1. 制备 0.8% 低熔点琼脂糖（LMP）：将 0.8 g LMP 琼脂糖加入 100 ml E3 溶液中，加热至完全溶解。在高温状态下，将 1 ml LMP 琼脂糖分装至 1.5 ml 微量离心管中，并置于 37 °C 加热金属块中。LMP 琼脂糖在 37 °C 下将保持液态。在 37 °C 条件下，向每份 1 ml LMP 琼脂糖中加入 40 µl 的 4 mg/ml（25 倍浓度）、pH 7.0 的三卡因（tricaine）。注意：若操作色素型品系，需向每 1 ml 分装的 LMP 琼脂糖中额外加入 20 µl 的 0.15%（50 倍浓度）PTU。
   1. 将剩余的 LMP 琼脂糖密封于 50 ml 管中，可在 4 °C 保存数月。
2. 将待成像的异源嵌合胚胎麻醉：向已含有胚胎的 25 ml E3 溶液中加入 1 ml 的 4 mg/ml（25 倍浓度）、pH 7.0 的三卡因。
3. 轻轻晃动培养皿，使胚胎聚集于中央。随后使用宽口塑料移液管，尽可能少地吸取液体将胚胎吸起。将移液管竖直放置，轻柔弹动管体，使胚胎沉降至移液管最底部。
   1. 当胚胎位于移液管底部时，将移液管尖端轻轻接触琼脂糖表面，将胚胎转移至 1 ml LMP 琼脂糖中。避免转移过多液体，以免稀释琼脂糖。
4. 从移液管中排出多余液体后，用同一移液管轻轻混匀琼脂糖中的胚胎，随后将全部琼脂糖和胚胎转移至玻璃底（No. 1.5 盖玻片）6 孔板的孔中。
   注意：将胚胎转移至成像板后，务必丢弃该移液管。残留的琼脂糖会在管内凝固，导致其无法再次使用。每次操作均应使用新的移液管。
5. 在体视显微镜下，使用固定在木柄解剖针末端的加样枪头调整胚胎位置，使其贴近盖玻片（以确保其处于物镜工作距离内），并调整至所需的成像方向。
   注意：在琼脂糖完全凝固前需持续调整胚胎位置。安装异源嵌合胚胎时，应根据需要成像的胚胎个体进行定位。由于连体胚胎的朝向具有随机性，部分组合可能难以同时成像两个个体。在此情况下，可用镊子和宽口塑料移液管将胚胎从琼脂糖中取出，再从不同角度重新包埋并进行成像。
6. 待琼脂糖凝固后，加入 2–3 ml 含三卡因（必要时含 PTU）的 E3 溶液覆盖样本。
7. 使用倒置宽场落射荧光、激光扫描共聚焦或转盘共聚焦显微镜对胚胎进行成像。根据所需成像条件选择最合适的物镜。如需全胚胎视野，使用 4x 物镜；如需观察特定组织，可选择更高倍率，例如 20x 物镜。
   注意：若使用正置显微镜，应将样本以类似上述方法包埋于 LMP 琼脂糖中，并置于盖玻片上。随后将盖玻片倒扣在载玻片上，载玻片周围需涂有一圈真空脂，中间填充相同的 E3-三卡因-PTU 溶液。
8. 使用免费图像分析软件（如 NIH Image J/FIJI）处理所获取的图像。
   注意：利用分割与追踪算法对细胞数量进行计数，并量化细胞迁移、细胞分裂等动态过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LMP 琼脂糖（超纯 LMP 琼脂糖）	Invitrogen	16520100
三卡因（粉末）（Tricaine Methanesulfonato，Tricaine-S）	Western Chemical Inc	MS 222
用于成像的玻璃底 6 孔板	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml 移液器泵（绿色）（Pipette Pump Pipettor）	Novatech International	F37898-0000