双光子激光轴突切割：一种在斑马鱼胚胎中损伤轴突并观察轴突修复的方法

摘要

来源：O'Brien G. S.，等。活体斑马鱼胚胎中的双光子轴突切割与共聚焦延时成像。J. Vis. Exp. (2009)。

本视频介绍了使用双光子激光轴突切断术损伤斑马鱼胚胎中的轴突，并观察轴突损伤后恢复过程的方法。

方案

1：使用自制双光子显微镜结合Chameleon钛宝石激光器进行双光子轴突切割

1. 准备成像。将固定好的胚胎置于载物台上的显微镜载片中。使用40倍（数值孔径0.8）水镜聚焦于一个胚胎。打开激光器。我们已能使用以下参数稳定地观察并损伤表达GFP的神经元。为在非损伤功率下观察轴突，请将激光波长设为910纳米（nm），功率设为30毫瓦（mW，所列功率为样品处的实际功率）。启动成像软件。我们使用Karel Svoboda实验室开发的ScanImage软件。
2. 按下“聚焦”按钮，用双光子激光扫描胚胎，定位需要进行轴突切断的轴突，并采集该轴突的图像。标记Z轴扫描的起始与终止位置，获取图像，并生成Z轴图像堆栈的最大投影图。
3. 将目标轴突分支区域放大至70倍，并停止扫描。将样品处的激光功率提高至损伤水平（180 mW），然后用激光进行一次单次扫描。我们通过将Z轴切片数设为1并点击“Grab”来实现此操作。该步骤应足以切断轴突。有关针对您的显微镜和实验目标优化此操作的详细方法，请参见讨论部分。
4. 缩小视野，将激光功率调回30 mW，并采集图像。

2：在蔡司510共聚焦/双光子显微镜上进行双光子轴突切断

1. 将固定好的胚胎放置在载物台上，使用25倍水镜或其他合适的物镜将其调至焦点。
2. 在多通道设置中打开双光子（910 nm）和氩离子（488 nm）激光器，以便可在两者之间切换。尽管两种激光均用于检测GFP，但双光子发射以红色显示，氩离子激光发射以绿色显示，以区分二者。
3. 使用氩离子激光器识别待损伤的轴突。在Z轴设置中标记出首个和最后一个光学切片。采集共聚焦图像，并对Z轴图像序列生成最大强度投影。
4. 选择待损伤的轴突区域，并将该区域调至焦点。关闭氩离子激光器，打开双光子激光器。以约9%透射强度的双光子激光扫描样品，确保轴突仍处于焦点中。
5. 点击“停止”按钮，以启用裁剪工具。使用裁剪功能放大目标区域。通常我们放大至约70倍（可在“模式”选项卡下查看放大倍数）。在“通道”选项卡下，将双光子激光的强度从约9%透射调整为15–20%透射。
6. 为切断轴突，按下“快速XY”按钮约1秒钟，然后按下停止按钮，以避免过度损伤。若操作成功，应可见轴突呈现为分散的碎片状。
7. 为确认轴突已受损，切换回488 nm氩离子激光器，采集另一幅共聚焦图像，并生成最大强度投影。