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Abstract

来源:Palanca A. M. S. et al.使用 ChEF-tdTomato 对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活。J. Vis. Exp.（2013 年）。

该视频通过激活转基因的体感神经元并用高速摄像机记录引发的行为反应来描述光遗传学技术。

Protocol

1. 用于行为实验的 Mount Larvae

1. 在 ddH 2 O 中制备 1.5% 低熔点琼脂糖，并储存在 42 °C 加热块中以防止其凝固。
2. 使用玻璃巴斯德移液器，将预先筛选的幼虫之一转移到 1.5% 低熔点琼脂糖管中，并加入尽可能少的蓝色/胚胎水。
3. 将一滴琼脂糖中的幼虫转移到一个小培养皿上。
4. 在解剖显微镜下，将幼虫背朝上放置。
5. 当琼脂糖凝固后，用薄剃须刀片（#11 手术刀）切掉琼脂糖，在整个幼虫周围留下一楔琼脂。
6. 在蛋黄的两侧做两个对角线切口;注意不要划伤幼虫。
7. 用胚胎/蓝水填充琼脂糖周围的区域。
8. 将琼脂糖从幼虫的躯干和尾巴中拉出（图 1）。

2 .准备高速相机和成像软件

1. 将高速摄像机安装到解剖镜上。
2. 将相机连接到计算机。
3. 打开计算机。
4. 打开高速摄像机。
5. 打开视频/成像软件（我们使用 AOS 成像软件，并将在此处描述使用过程，但其他成像软件同样可接受）。
6. 相应地调整相机设置（即每秒 1,000 帧 （fps）、50% 触发缓冲区或其他首选设置）。
7. 开始录制。

3. 使用 473 nm 激光激活单个神经元

1. 连接刺激器、激光和光缆。
2. 打开刺激器。
3. 将刺激器设置为最大 5 伏特和 5 毫秒的脉冲持续时间。
4. 根据制造商的说明打开激光。
5. 使用解剖显微镜将光缆尖端定位在具有 ChEF-tdTomato 表达的神经元的细胞体附近（图 1）。
6. 传递蓝光脉冲以激活感觉神经元。
7. 使用设置为每秒 500 或 1,000 帧的高速摄像机录制行为。
8. 根据需要重复实验，每次激活之间等待 1 分钟以避免习惯化。（我们为每个神经元记录至少三个反应）。
9. 要释放幼虫，请用镊子撬开琼脂糖，注意不要伤害动物。可以允许这种动物进一步发展，并且可以在较老的阶段重复该过程以描述行为的发展。胚胎也可以重新安装以进行活化细胞的高分辨率共聚焦成像，以将行为与细胞结构相关联，如下所述。
10. 将幼虫转移到装有新鲜蓝色/胚胎水的培养板中。我们使用 24 孔板来跟踪单个幼虫。

Representative Results

Materials

Low Melt agarose 	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100×15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent