斑马鱼光遗传学：激活基因改造的体感神经元以研究幼鱼行为反应

摘要

来源：Palanca A. M. S.，等。利用ChEF-tdTomato对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活。J. Vis. Exp. (2013)。

本视频介绍了通过激活基因改造的体感神经元，并使用高速摄像机记录所引发的行为反应的光遗传学技术。

方案

1. 为行为实验固定幼虫

1. 用去离子水配制1.5%低熔点琼脂糖溶液，并置于42 °C加热块中保温，防止凝固。
2. 使用玻璃巴斯德吸管，将一条预先筛选好的幼虫转移至含有1.5%低熔点琼脂糖的离心管中，尽量减少蓝色/胚胎水的带入。
3. 将幼虫连同一滴琼脂糖转移至小型培养皿中。
4. 在解剖显微镜下，将幼虫调整为背侧朝上。
5. 待琼脂糖凝固后，用细 razor 刀片（#11 外科刀）切去周围琼脂糖，仅保留围绕整个幼虫的一小块楔形琼脂糖。
6. 在卵黄两侧各做一条斜向切口，注意避免损伤幼虫。
7. 用胚胎/蓝色水填充琼脂糖周围的区域。
8. 将琼脂糖从幼虫的躯干和尾部轻轻拉开（图1）。

2 . 准备高速相机和成像软件

1. 将高速摄像机安装到解剖显微镜上。
2. 将相机连接到计算机。
3. 打开计算机。
4. 打开高速摄像机。
5. 打开视频/成像软件（我们使用 AOS 成像软件，并在此描述其操作流程，但也可使用其他成像软件）。
6. 根据需要调整相机设置（即 每秒1,000帧（fps），50%触发缓冲区或其他首选设置。
7. 开始记录。

3. 使用 473 nm 激光激活单个神经元

1. 连接刺激器、激光器和光纤电缆。
2. 打开刺激器电源。
3. 将刺激器设置为最大5伏电压，脉冲持续时间为5毫秒。
4. 根据制造商说明打开激光器。
5. 使用解剖显微镜将光纤电缆的尖端定位在表达ChEF-tdTomato的神经元细胞体附近（图1）。
6. 给予蓝光脉冲以激活感觉神经元。
7. 使用设置为每秒500或1,000帧的高速相机记录行为。
8. 根据需要重复实验，每次激活之间等待1分钟，以避免习惯化。（我们对每个神经元至少记录三次反应。）
9. 如需释放幼虫，用镊子小心撬开琼脂糖，注意不要损伤动物。该动物可继续培养，也可在更晚的发育阶段重复此操作，以表征行为的发育过程。此外，可将胚胎重新装片，进行高分辨率共聚焦成像，以关联行为与细胞结构，如下文所述。
10. 将幼虫转移至含有新鲜蓝水/胚胎水的培养板中。我们使用24孔板来分别标记个体幼虫。

结果

图1. 固定的斑马鱼幼虫示意图及参与幼虫触觉反应的代表性神经元。 斑马鱼幼虫部分固定于1.5%低熔点琼脂糖中（以虚线表示围绕幼虫头部前端的部分）。图中以红色显示三叉神经元（位于头部）和Rohon-Beard神经元（位于躯干）。幼虫体内Mauthner细胞以虚线轮廓标出。视神经（白色）位于Rohon-Beard神经元胞体上方。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点琼脂糖 	Sigma	A9045	或同类产品
培养皿（100×15 mm）	任意品牌	任意货号
非无菌手术刀片	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	或同类产品
蓝色/胚胎用水			10 L 去离子水，0.6 g Instant Ocean，6 滴亚甲蓝
高速相机	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	或同类产品
玻璃巴斯德吸管	Fisher	1367820B	或同类产品（直径 10–15 mm）
473 nm 便携式激光器	Crystal lasers	CL-473-050	或更高功率，带 TTL 控制选项
S48 刺激器	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	或同类产品
三卡因（Tricaine）	Sigma	A5040
200 μm 光纤	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	跳线，长度：3 m，端口 A：FC/PC，端口 B：FC/PC，护套：FT030
50 μm 光纤	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	跳线，长度：3 m，端口 A：FC/PC，端口 B：FC/PC，护套：FT030
24 孔细胞培养板	Genesee	25-102	或同类产品