全细胞膜片钳电生理学：一种研究神经元电学特性的方法

摘要

来源：Roy, B., 等. 斑马鱼胚胎 Mauthner 细胞的膜片钳记录. J. Vis. Exp. (2013)。

本方案描述了一种称为全细胞膜片钳电生理的技术，该方法用于研究斑马鱼胚胎中 Mauthner 神经元及其他网状脊髓细胞的电学特性。

方案

1. 膜片钳记录（全细胞模式）

1. 所有记录均在全细胞膜片钳模式下进行。将记录浴槽置于电生理实验装置的显微镜载物台上。我们的载物台是固定的，直立式膜片钳显微镜则通过螺栓固定在可移动的显微镜平台或显微镜平移装置上。
2. 使用水平拉制仪（P-97；Sutter Instruments Co.）从WPI公司提供的薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制膜片钳电极。经火焰抛光至边缘光滑后，电极尖端直径约为0.2–0.4 μm，电极杆部锥形部分长度约为4 mm。
3. 将电极连接至电生理装置的放大器头架上。保持头架与水平轴呈约45°角至关重要，因为这可确保电极以适合在Mauthner细胞上形成高阻封接的角度进入。
4. 在即将进入浴液前，向电极内施加少量正压，以减少污染电极尖端的风险。记录微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）时，浴液中包含1 μM河豚毒素（TTX）以阻断动作电位，5 μM士的宁（strychnine）以阻断甘氨酸受体，以及10 μM荷包牡丹碱（bicuculline）或100 μM苦味毒（picrotoxin）以阻断GABAA受体。记录微小抑制性突触后电流（mIPSCs）时，浴液中包含1 μM TTX、犬尿酸（kynurenic acid），以及根据所关注的受体活性选择使用荷包牡丹碱或士的宁。
5. 在电极接近M细胞时，保持电极内有少量正压。正压会轻柔地使细胞发生侧向移动，当电极正对细胞上方时，会在细胞膜上形成一个小凹陷。将电极保持原位数秒，以轻柔清洁细胞表面，从而利于电极与细胞膜之间形成牢固的封接。释放电极内的正压后即可启动封接过程，同时施加轻微负压并配合负向电极电位，通常在数秒内即可形成吉欧姆（GΩ）级封接。
6. 将放大器的钳制电位调整为-60 mV。通过一系列短暂的吸力脉冲破裂细胞膜。立即开始记录膜电位，并尽量减少电容伪迹。对细胞电容（Cm）和通路（串联）电阻（Ra）进行70–85%的补偿。应每30秒至1分钟常规监测Ra，若其变化达到或超过20%，则应中止实验。
7. 实验结束后，在已获取足够数据的情况下，使用镊子移除脑干以处死标本。此时可开始数据分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
拉管仪	Sutter Instruments Co	P-97
直立式膜片钳显微镜	Leica Microsystems	DMLFSA
放大器	Molecular Devices	200B
微操纵器	Siskiyou Inc.	MX7500