肌肉注射（IM）：向成年斑马鱼背肌递送化合物

摘要

来源：Myllymäki, H.，等。用于基于DNA疫苗临床前筛选的成年斑马鱼免疫方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了将化合物注入成年斑马鱼背部肌肉的肌肉注射技术。

方案

1. DNA 疫苗注射与电穿孔

1. 根据本方案进行免疫接种时，使用健康、6至12月龄的成年斑马鱼。将鱼饲养在循环水系统中，光照周期为14小时光照/10小时黑暗，每升水中最多饲养7条鱼。
2. 用养殖用水配制0.02%的三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）溶液（pH 7），用于麻醉鱼类。使用直径10 cm的培养皿或类似容器。
3. 准备一个恢复用鱼缸：将3 L清洁的系统用水加入5 L烧杯中。
4. 准备一个疫苗接种垫，用于在接种过程中固定鱼体位置。取一块5 × 7 cm²、厚2至3 cm的海绵，用手术刀片或锋利剪刀在海绵上切出一条凹槽。
   注意：同一块疫苗接种垫可用于多次实验。实验间应将海绵浸泡于70%乙醇中进行消毒，并晾干备用。
5. 将海绵充分浸入系统用水中润湿，然后放置于培养皿上。
6. 在接种前24小时停止喂食。
7. 将一条斑马鱼放入含有0.02%三卡因的培养皿中进行麻醉。待鱼体对触碰刺激无反应且鳃部无运动时，表明麻醉完成。每次仅麻醉一条鱼。
8. 使用塑料勺将麻醉后的斑马鱼转移至湿润的海绵上，使鱼腹面朝下置于凹槽内。正确位置应确保鱼头及大部分身体位于凹槽内，而背鳍和尾部则从凹槽中伸出。
9. 在显微镜下，使用显微操作仪的X轴和Y轴微调旋钮，将针头以约45°角小心插入斑马鱼背肌附近。
10. 寻找背鳍前方无鳞片的小区域，此处进针无需施加过大压力。若感到阻力，应尝试邻近位置。避免损伤脊柱、背鳍或鳞片。
    注意：若针头在推进过程中弯曲，可将其略微剪短。
11. 使用脚踏开关逐步将疫苗溶液注入肌肉。通过显微镜观察注射过程：酚红进入肌肉组织时可见。根据需要调整脉冲持续时间。
    注意：也可使用气动泵前面板上的脉冲启动按钮进行注射。但使用远程脚踏开关可腾出另一只手通过十圈调节旋钮控制脉冲长度。避免注射过快，以免造成过度组织损伤。确保不注入任何空气。
12. 注射后立即对鱼进行电穿孔。确保鱼仍处于麻醉状态。保持鱼体位于海绵上，并将其置于镊形电极之间，使电极位于注射部位两侧。不要过度夹紧电极镊子，但需确保两个电极均与鱼体接触。
    1. 按下电穿孔仪上的启动按钮，施加6次40 V、50 ms的脉冲。
    2. 轻柔地将鱼转移至恢复缸中。
    3. 每次电穿孔后，用70%乙醇擦拭电极进行清洁。
       注意：接种后应密切监测鱼的健康状况。若鱼出现不适症状（麻醉恢复缓慢、游动异常、呼吸急促），应使用0.04%三卡因实施安乐死。恢复后，将鱼转移至循环水系统并正常喂食。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酚红钠盐	Sigma-Aldrich	114537-5G
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma	A5040-100g	麻醉与安乐死溶液
镊子型电极（7 mm）套装	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	镊子型电极
铝硅酸盐毛细管	Harvard apparatus	30-0108
显微操作器	Narishige	MA-153
显微镜	Olympus	ZS61
ECM 电脉冲方波发生器	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
塑料勺
海绵
泡沫塑料工作台