胚胎显微注射：一种将化合物递送至斑马鱼卵黄的技术

摘要

来源：Sorlien, E. L.，等。在模式系统斑马鱼（Danio rerio）中高效产生并鉴定CRISPR/Cas9介导的基因敲除。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种通过胚胎显微注射将化合物递送至斑马鱼卵黄囊的技术。

方案

1. 将CRISPR组分显微注射至斑马鱼胚胎中

1. 在注射前一晚设置繁殖缸，将所需数量的雄鱼和雌鱼（通常为2条雌鱼和1或2条雄鱼）放入带有隔离板的繁殖缸中。
2. 制备显微注射用培养皿：将35 mL熔化的含1.5%琼脂糖的1×E3培养基 （见材料表） 倒入直径10 cm的培养皿中，加入0.01%亚甲蓝（一种杀菌剂），然后轻轻放入塑料模具，在溶液中形成楔形凹槽，轻敲模具以去除气泡。
3. 让琼脂糖凝固后，加入少量培养基并将培养皿用石蜡膜包裹，防止干燥，于4 °C保存。
   注意： 注射用培养皿可重复使用数周，直至孔洞变形、干燥或开始长霉为止。
4. 在注射当天早晨，将纯化的sgRNA和Cas9蛋白置于冰上解冻。操作时请始终佩戴手套，防止RNase污染，并使用无RNase的枪头和离心管。
5. 通过将Cas9蛋白与sgRNA按Cas9:sgRNA为2:1的比例混合，配制5 µL注射液，使终浓度为400 pg/nL Cas9蛋白和200 pg/nL sgRNA。室温孵育Cas9/sgRNA混合液5分钟，使Cas9与sgRNA形成核糖核蛋白复合物。加入0.5 µL 2.5% (w/v) 酚红溶液 （见材料表），再用无RNase水补足至终体积5 µL。
   注意： 溶液的离子强度已被证明会影响Cas9/sgRNA....

结果

图 1：注射后 24 小时胚胎健康状况的比较。 一个存活的胚胎（A）发育至 24 小时（hpf），可明显区别于发育中止的胚胎（B）。与（A）相比，形态类似（B）或具有显著异常特征（如脊柱弯曲或头部和眼睛发育异常）的胚胎应从培养皿中移除

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无RNase水	任何品牌		用于合成向导RNA。Thermo<br/> &nbsp;Fisher和Qiagen均有提供<br/> &nbsp;合适的无RNase水。
E3胚胎培养基	实验室自制		用于胚胎培养和<br/> 制备注射板。<br/> 配方：http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140	加入1× E3培养基中以防止胚胎真菌生长。
培养皿	Thermo Fisher	FB0875711Z	用于存放胚胎和制备注射板
琼脂糖	Denville	CA3510-8	用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
微注射模具	Adaptive Science Tools	TU-1	用于在注射过程中固定胚胎的凹槽制作
酚红	Sigma-Aldrich	P0290	用于注射过程的可视化染料
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	用于校准注射针的注射体积。
移液管	任何品牌		用于转移胚胎
刀片	Thermo Fisher	11295-10	用于切割注射针和成年鱼尾部剪切。
培养箱			用于将胚胎维持在28.5 °C。
垂直式拉针仪	David Kopf Instruments	700C	用于制备注射针。附加拉针操作说明：<br/> http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
毛细管	Sutter Instruments	BF100-58-10	用于制备注射针。
微量加样吸头	Eppendorf	930001007	用于将溶液装入注射针中
显微注射仪	World Precision Instruments	PV 820	用于胚胎注射。
解剖显微镜	Leica		用于胚胎注射。
微波炉	任何品牌		用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
天平	任何品牌		用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
手套	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
N2	任何品牌		用于从毛细管中排出液体以进行胚胎注射
PCR条形管	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
200 &micro;L吸头	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
10 &micro;L吸头	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
微量移液器	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。