胚胎显微注射：一种将化合物递送至斑马鱼卵黄的技术

摘要

来源：Sorlien, E. L.，等。在模式系统斑马鱼（Danio rerio）中高效产生并鉴定CRISPR/Cas9介导的基因敲除。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种通过胚胎显微注射将化合物递送至斑马鱼卵黄囊的技术。

方案

1. 将CRISPR组分显微注射至斑马鱼胚胎中

1. 在注射前一晚设置繁殖缸，将所需数量的雄鱼和雌鱼（通常为2条雌鱼和1或2条雄鱼）放入带有隔离板的繁殖缸中。
2. 制备显微注射用培养皿：将35 mL熔化的含1.5%琼脂糖的1×E3培养基 （见材料表） 倒入直径10 cm的培养皿中，加入0.01%亚甲蓝（一种杀菌剂），然后轻轻放入塑料模具，在溶液中形成楔形凹槽，轻敲模具以去除气泡。
3. 让琼脂糖凝固后，加入少量培养基并将培养皿用石蜡膜包裹，防止干燥，于4 °C保存。
   注意： 注射用培养皿可重复使用数周，直至孔洞变形、干燥或开始长霉为止。
4. 在注射当天早晨，将纯化的sgRNA和Cas9蛋白置于冰上解冻。操作时请始终佩戴手套，防止RNase污染，并使用无RNase的枪头和离心管。
5. 通过将Cas9蛋白与sgRNA按Cas9:sgRNA为2:1的比例混合，配制5 µL注射液，使终浓度为400 pg/nL Cas9蛋白和200 pg/nL sgRNA。室温孵育Cas9/sgRNA混合液5分钟，使Cas9与sgRNA形成核糖核蛋白复合物。加入0.5 µL 2.5% (w/v) 酚红溶液 （见材料表），再用无RNase水补足至终体积5 µL。
   注意： 溶液的离子强度已被证明会影响Cas9/sgRNA复合物的溶解度，因此添加KCl可能提高那些插入缺失（indel）形成率较低的sgRNA的切割效率。
6. 使用显微拉针仪拉制1.0 mm玻璃毛细管以制作注射针。使用新的剃刀刀片或镊子剪断新制针尖，获得具有一定倾斜角度的开口，以便轻松穿透卵膜和卵黄囊。
7. 将注射针安装至连接显微注射仪的显微操作器上，并打开气源。在光学显微镜下，根据特定设备校准所需的放大倍数，调节注射压力，直至针头能持续地将1 nL溶液注入盛有矿物油的培养皿中。
   注意： 针的质量至关重要。在进行正式实验前，应练习制作注射针并注射至胚胎卵黄囊，直至熟练掌握该技术。
8. 移除隔离板，让鱼类交配约15分钟。
   注意： 延长交配时间可获得更多胚胎，但注射应在胚胎处于单细胞阶段时完成，以最大化Cas9切割发生的早期性，从而降低基因嵌合现象。胚胎也可在后续阶段（2–4细胞期）注射，但这可能会降低修饰等位基因的生殖系传递率。
9. 使用滤网收集卵子，并用含0.0001%亚甲蓝的1×E3培养基冲洗至直径10 cm的培养皿中。在光学显微镜下检查卵子健康状况，去除未受精卵和杂质。
10. 另取一个标记好的培养皿，保留10–15个胚胎作为未注射对照组。
11. 使用移液器将卵子轻轻排列在已预温至室温的注射板上。
12. 在解剖显微镜下以2.5倍放大倍数，向每个胚胎的卵黄囊内注射1 nL溶液，使每个胚胎接受总量为400 pg Cas9蛋白和200 pg sgRNA。
    注意： 若需或有必要提高切割效率，可将注射液中Cas9蛋白终浓度提高至800 pg/nL，sgRNA提高至400 pg/nL；但此举可能增加脱靶切割和/或降低胚胎存活率。也可通过直接向细胞内注射来提高切割效率。然而，向卵黄囊注射技术难度较低，且足以产生具有高生殖系传递率的个体（>70%后代携带修饰等位基因）。
13. 将注射后的胚胎转移至正确标记的培养皿中，加入含亚甲蓝的1×E3培养基覆盖，并置于设定为28 °C的胚胎培养箱中。
14. 受精后24小时（hpf），检查注射胚胎的健康状况，移除死亡或发育异常的个体，并更换培养基（见 图1）。将存活率与未注射对照组进行比较。
    注意： 当靶向非必需基因时，相对于未注射对照组，预期致死率应低于10%。若观察到注射sgRNA的群体相较于未注射对照组出现较高的致死率，可能表明靶基因对发育至关重要，或存在脱靶效应导致发育失败。此时可能需要减少注射的CRISPR试剂用量，或设计新的具有较低脱靶效应的sgRNA。
15. 将胚胎放回培养箱，继续培养至72 hpf，每日更换培养基以维持胚胎健康。

结果

图 1：注射后 24 小时胚胎健康状况的比较。 一个存活的胚胎（A）发育至 24 小时（hpf），可明显区别于发育中止的胚胎（B）。与（A）相比，形态类似（B）或具有显著异常特征（如脊柱弯曲或头部和眼睛发育异常）的胚胎应从培养皿中移除

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无RNase水	任何品牌		用于合成向导RNA。Thermo<br/> &nbsp;Fisher和Qiagen均有提供<br/> &nbsp;合适的无RNase水。
E3胚胎培养基	实验室自制		用于胚胎培养和<br/> 制备注射板。<br/> 配方：http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140	加入1× E3培养基中以防止胚胎真菌生长。
培养皿	Thermo Fisher	FB0875711Z	用于存放胚胎和制备注射板
琼脂糖	Denville	CA3510-8	用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
微注射模具	Adaptive Science Tools	TU-1	用于在注射过程中固定胚胎的凹槽制作
酚红	Sigma-Aldrich	P0290	用于注射过程的可视化染料
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	用于校准注射针的注射体积。
移液管	任何品牌		用于转移胚胎
刀片	Thermo Fisher	11295-10	用于切割注射针和成年鱼尾部剪切。
培养箱			用于将胚胎维持在28.5 °C。
垂直式拉针仪	David Kopf Instruments	700C	用于制备注射针。附加拉针操作说明：<br/> http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
毛细管	Sutter Instruments	BF100-58-10	用于制备注射针。
微量加样吸头	Eppendorf	930001007	用于将溶液装入注射针中
显微注射仪	World Precision Instruments	PV 820	用于胚胎注射。
解剖显微镜	Leica		用于胚胎注射。
微波炉	任何品牌		用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
天平	任何品牌		用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
手套	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
N2	任何品牌		用于从毛细管中排出液体以进行胚胎注射
PCR条形管	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
200 &micro;L吸头	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
10 &micro;L吸头	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。
微量移液器	任何品牌		用于本实验方案的所有步骤。