斑马鱼脑解剖：一种鱼类神经生物学技术

摘要

来源：Lopez-Ramirez M. A. 等., 成年斑马鱼脑源性神经球的分离与培养. J. Vis. Exp. (2016).

本视频介绍了从成年斑马鱼中进行脑组织显微解剖的技术。该方法有助于获取源自全脑的神经球，以便进一步研究。

方案

1. 成年斑马鱼脑的解剖

1. 通过在100 mm × 15 mm的培养皿中填充凝胶冰袋来制备解剖台。然后将培养皿盖子盖上，并在-20 °C下孵育直至凝胶完全冻结。在盖子上方放置一张洁净的滤纸，并用塑料膜将滤纸和培养皿一起包裹。
2. 每次使用前，用70%乙醇或加热方法清洁并灭菌所有显微解剖器械。将所有已灭菌的解剖器械放置在解剖显微镜附近，并在实施安乐死后立即把解剖台置于带光纤照明的显微镜下。
3. 采集2条成年斑马鱼用于全脑神经球的制备；采集3至4条斑马鱼用于从分离的脑区生成神经球。
4. 采用机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案对成年斑马鱼（8–12月龄）实施安乐死。随后将鱼浸入75%乙醇中5–10秒，迅速放入解剖台，并使用手术刀在鳃部水平进行断头。
   1. 为实施动物安乐死，给予三卡因甲磺酸盐过量（300 mg/L），直至动物心跳逐渐减缓并停止循环，然后将其浸入冰水中。
5. 将头部背侧朝下，使用剪刀从切割面沿纵向剪至口部。用镊子暴露颅骨基部，并去除所有邻近组织。从脊髓起始处向视顶体方向剪开颅骨的侧壁。
6. 使用剪刀剪除并移除视神经，然后在视顶体水平移除颅骨最外侧两侧部分。将头部翻转为腹侧朝上。使用镊子剥离颅骨最顶端剩余的部分。
7. 将脑组织连同颅骨残余部分转移至含有解剖培养基（DMEM/F12 加青霉素/链霉素）的新培养皿中。使用显微刀的塑料手柄在解剖培养基中清洗脑组织，保持所有脑结构完整无损。
8. 从此步骤起，继续使用整条斑马鱼脑进行后续操作。
   1. 也可根据需要调整本方案，针对特定脑区进行操作，以从整脑或使用新鲜解剖刀分离的端脑、视顶体/间脑或小脑组织中生成神经球。使用神经特异性荧光斑马鱼转基因品系，参照图1分离目标脑区。

结果

图1：斑马鱼脑源性神经球的分化。（A–C、E）在Z-分化培养基中培养1天（A，DiVd1）、3天（B，DiVd3）和4天（C 和 D，DiVd4）后，全脑来源神经球的相差显微图像。（E）12月龄Tg(GFAP:DsRed)斑马鱼全脑的背侧视图。如图所示，分离并收集端脑（Tel）、中脑顶盖（Tec）和小脑（Cer）。（D）来自中脑顶盖、端脑和小脑的DiVd4神经球在传代0代（P0）、1代（P1）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 1x 	Life Technologies	 11330-032
青霉素-链霉素  	Life Technologies	15140-122
三卡因 MS-222   	Sigma	A5040	4 mg/ml 的储备液