原位注射：将组织特异性癌细胞植入成年小鼠

摘要

来源：Katsuta, E.，等。建立小鼠原位转移性乳腺癌模型并实施小鼠根治性乳房切除术 J. Vis. Exp. (2018)。

该视频展示了在小鼠模型中进行乳腺癌原位接种的技术。与皮下注射或非手术注射相比，该技术具有更高的成瘤率，且肿瘤大小和形态的变异性更小。

方案

1. 细胞制备（适用于10只小鼠）

注意： 细胞从培养皿上解离后应在1小时内接种，以避免细胞活力下降。具体而言，细胞解离后应在15分钟内将细胞悬液混入胶状蛋白质混合物中，以维持其活力。

1. 在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养4T1-luc2细胞（一种表达荧光素酶的小鼠乳腺腺癌细胞系）。
2. 在组织培养超净台中，使用10 mL移液管以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗10 cm培养皿中的贴壁4T1-luc2细胞。使用P1000移液器加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。随后，使用5 mL移液管加入4 mL生长培养基（含10% FBS的RPMI-1640），将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。在180 x g 条件下离心5分钟。
3. 吸除上清液，将细胞重悬于2 mL PBS中，然后使用血细胞计数板进行细胞计数。
4. 在组织培养超净台中，将2 × 10⁶ 个4T1-luc2细胞重悬于40 μL冷PBS（pH 7.4，4 °C）中。
5. 在组织培养超净台中，将40 μL细胞悬液与360 μL胶状蛋白混合物在冰上置于1.5 mL微量离心管中混合。
   注意： 最终浓度为1 × 10⁵/20 μL（PBS与胶状蛋白混合物比例为1:9）。对于原位模型（不进行乳房切除术），使用最终浓度1 × 10⁴/20 μL，以避免在两周内达到安乐死标准（肿瘤大小> 2 cm）。

2. 肿瘤细胞接种

1. 将小鼠放入麻醉诱导室，使用2-4%异氟烷和0.2 L/min的氧气流速，直至小鼠呼吸平稳（2–3分钟）。
2. 抓握小鼠，并在肩部皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡。
3. 通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉充分。将小鼠的鼻子插入小鼠面罩的孔中，通过连接至活性炭过滤罐装置的吸入式麻醉系统给予 2–4% 异氟烷和 2 L/min 的氧气流。
4. 用实验室胶带固定小鼠的四肢，并使用棉签依次以氯己定、碘酒和75%乙醇对其皮肤进行消毒。
5. 使用无菌显微剪刀在前胸壁中部做一处5 mm的皮肤切口，提起切口右侧的皮肤，用剪刀将皮肤与胸壁分离，然后翻转皮肤以暴露右侧第2乳腺脂肪垫。
6. 使用1 mL胰岛素注射器（28.5 G针头），在直视下经切口将20 μL癌细胞悬液小心注入脂肪垫中。
   注意： 针应穿过伤口，而非皮肤。在拔出针头前，需将其在脂肪垫中保持5秒，以使凝胶状蛋白质混合物有足够时间凝固。
7. 使用无菌5-0不可吸收缝线缝合皮肤切口。
8. 手术后，将动物放回清洁的笼子中，并持续观察直至其恢复并能自由活动（约1–2分钟后）。 若动物在24小时内未表现出健康状态 手术期间，给予布托啡诺（0.2 mg/kg）。
9. 术后7天在麻醉下拆除缝线（参见步骤2.1）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微解剖剪	Roboz	RS-5983	用于癌细胞接种和乳房切除术
5-0 丝线缝合线	Look	774B F
Roswell Park Memorial Institute 1640	Gibco	11875093	用于细胞培养
胎牛血清	Gibco	10437028	用于细胞培养
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200056	用于细胞培养
干式灭菌剂（Germinator 500）	Braintree Scientific	GER 5287-120V	用于癌细胞接种和乳房切除术
持针器	Roboz	RS-7830	用于癌细胞接种和乳房切除术
Adson 镊子	Roboz	RS-5233	用于癌细胞接种和乳房切除术
动物毛发剪	Wahl	9908-717	用于癌细胞接种和乳房切除术
Matrigel	Corning	354234	用于癌细胞接种