三维共培养与直接相互作用：癌细胞与单核细胞共培养以研究其相互作用

摘要

来源：Espinoza-Sánchez，等。基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析。J. Vis. Exp. （2018年）。

本视频介绍了在基于细胞外基质提取物（ECME）的环境中，将乳腺癌细胞与单核细胞进行三维共培养的方法，以研究它们之间的相互作用。该方法有助于研究胶原蛋白降解、免疫细胞募集以及细胞侵袭等特定特征。

方案

1. 具有直接相互作用的3D共培养

1. 在细胞培养前，使用不同的荧光染料标记 BrC 细胞和单核细胞，以便在培养后独立分选每种细胞系，用于分析 mRNA 和蛋白质表达。使用市售的香豆素和罗丹明衍生物，这些染料可自由穿过活细胞的细胞膜。一般标记步骤如下：
   1. 准备目标 BrC 细胞的单层（25 cm² 培养瓶中含 2 × 10⁶ 个细胞），弃去原培养基，加入足量预热的荧光染料工作液（将荧光染料以 1:2,000 比例溶于不含任何添加剂的标准基础培养基中）。在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育 30 分钟。吸除染料溶液，用足量 1× PBS 轻柔洗涤一次。吸除 PBS，加入标准培养基。
   2. 用 2 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 0.48 mM EDTA 的溶液在 37 °C 下消化细胞单层 5–10 分钟。加入 200 µL FBS 终止消化反应，并加入 7 mL 不含添加剂的相应培养基。用移液器吹打重悬细胞。取 10 µL 细胞悬液，在血细胞计数板中进行细胞计数。完成计数后继续进行共培养实验。
   3. 在室温下以 430 × g 离心 5 分钟收集细胞（此步骤优先进行，因单核细胞为悬浮生长）。弃去上清液，用 3 mL 预热的荧光染料工作液（染料按 1:2,000 比例溶于不含添加剂的标准基础培养基）轻柔重悬细胞。在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育 30 分钟。
   4. 再次离心收集细胞，弃去染料工作液，用 5–7 mL 1× PBS 轻柔重悬细胞。再次离心，弃去 PBS，用 5–7 mL 标准培养基重悬细胞。取 10 µL 细胞悬液在血细胞计数板中进行细胞计数。完成计数后继续进行共培养实验。
2. 按以下方式设置共培养体系：在 4 孔板系统的每个孔底部铺加足量 ECME，使其形成均匀覆盖的薄层。每孔接种 20 µL 含 5 × 10⁵ 个标记 BrC 细胞的单细胞悬液。
3. 在 37 °C 孵育 15–20 分钟后，向每孔加入含 2.5 × 10⁵ 个标记单核细胞的悬液 80 µL（用含 60% ECME 的检测培养基配制）。
4. 在 37 °C 下孵育 15–20 分钟，使 ECME 完全凝固。
5. 每孔加入 1 mL BrC 细胞与单核细胞培养基按 1:1 比例混合的培养液。
6. 将共培养体系置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育 24 小时、48 小时或 5 天，以在不同时间点追踪变化。
7. 降解 ECM 蛋白以回收细胞。吸除并弃去培养基，每孔加入 0.5 mL 含 0.1% 胰蛋白酶和 0.25% EDTA 的 1× PBS，于 37 °C 孵育 3 小时。孵育结束后，加入 0.5 mL 含 10% FBS 的 1× PBS 以中和胰蛋白酶活性，并剧烈吹打使细胞充分重悬，获得单细胞悬液。
8. 在室温下以 765 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，用 5 mL 含 10% FBS 的 1× PBS 重悬细胞。重复此步骤一次。
9. 使用适当的仪器对细胞悬液进行荧光激活细胞分选（FACS），确保最终分选的细胞群体纯度至少达到 95%。
10. 分选完成后，用无菌 1× PBS 洗涤细胞，以 430 × g 离心 5 分钟收集细胞，再用无菌 1× PBS 重悬。细胞可根据特定实验方案进行 RNA 提取或蛋白质分析。
11. 每项实验重复三次，并包括各细胞系单独的三维培养作为对照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
U937	美国典型培养物保藏中心 ATCC	CRL-1593.2	单核细胞系/组织细胞性淋巴瘤
THP-1	美国典型培养物保藏中心 ATCC	TIB-202	单核细胞系/急性单核细胞白血病
MCF-10A	美国典型培养物保藏中心 ATCC	CRL-10317	非转化乳腺细胞系
MCF-7	美国典型培养物保藏中心 ATCC	HTB-22	乳腺癌细胞系
MDA-MB-231	美国典型培养物保藏中心 ATCC	HTB-26	乳腺癌细胞系
RPMI 1640 培养基	GIBCO BRL 生命技术公司	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL 生命技术公司	11039-021
抗生素/抗真菌素	GIBCO BRL 生命技术公司	15240-062	100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，以及 0.25 µg/mL 两性霉素B
胎牛血清	GIBCO BRL 生命技术公司	16000-044
马血清	GIBCO BRL 生命技术公司	16050114
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1X	GIBCO BRL 生命技术公司	25300-062
PBS 1X（磷酸盐缓冲液）	GIBCO BRL 生命技术公司	20012-027
表皮生长因子（EGF）	PeproTech	AF-100-15 (1.00mg)
胰岛素	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
氢化可的松	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
霍乱毒素 霍乱弧菌	SIGMA-ALDRICH	C8052-1MG
Matrigel	康宁公司	356237	Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤，细胞外基质提取物，-20°C 保存，使用前置于 4°C
带盖 Lab-Tek 培养腔载玻片（8 孔）	Nalge Nunc 国际公司	177402