去细胞化乳腺脂肪垫：从乳腺脂肪垫中提取细胞外基质水凝胶

摘要

来源：Alves 等.，《利用细胞外基质水凝胶研究正常组织的辐射效应》，J. Vis. Exp. （2019年）。

本视频介绍了一种通过脱细胞化小鼠乳腺脂肪垫来制备细胞外基质水凝胶的技术 离体 辐照 用于 体外 研究。该水凝胶有助于模拟 体内 放射治疗后乳腺组织环境，用于研究肿瘤细胞行为。

方案

1. 脱细胞化

注意：本方案改编自先前发表的脂肪脱细胞方法，该方法采用离子型去污剂脱氧胆酸钠而非十二烷基硫酸钠，以有效去除DNA。

1. 在 第1天，从-80 °C取出冷冻的乳腺脂肪垫（Mammary Fat pads，MFPs），室温下解冻。
2. 解冻后，用无尘纸短暂吸干MFPs表面液体，使用分析天平称重。
3. 使用镊子配合剪刀或手术刀，将组织切成3 mm × 3 mm × 3 mm的样本，用于完整细胞外基质（ECM）研究，其余组织用于水凝胶制备。
   注意：样本数量取决于检测方法的数量，例如下文描述采集两个样本：一个用于石蜡包埋（步骤1.5），另一个（如需要）用于在冷冻切片包埋介质中冷冻（参见 材料表 及步骤1.6）。
4. 称量组织。若计划进行石蜡包埋切片，请继续步骤1.5；若计划在冷冻切片包埋介质中冷冻切片，请继续步骤1.6。
5. 在化学通风橱中，将组织浸入10%中性缓冲福尔马林（NBF）（参见 材料表）中，4 °C固定24小时。用PBS洗涤3次，每次5分钟。再将组织浸入30%蔗糖溶液中，4 °C孵育48小时。
   1. 在该组织块取出后立即称重，继续进行步骤1.6。
6. 在化学通风橱中，将MFP组织块放入已标记的、装有冷冻切片包埋介质的包埋盒中，加入足量包埋介质完全覆盖组织。
   1. 将包埋盒放入盛有2-甲基丁烷（参见 材料表）的烧杯中，该烧杯需预先用液氮冷却。烧杯中2-甲基丁烷的量应足以覆盖底部，但不足以淹没包埋盒，以避免冷冻切片包埋介质直接接触2-甲基丁烷。将包埋盒置于2-甲基丁烷中，直至包埋介质完全冻结并变为不透明。
   2. 用铝箔包裹包埋盒，标记后于-80 °C保存，待后续切片使用。
      注意：直接放入冷冻切片包埋介质的组织切片厚度为5 μm，而经蔗糖孵育的组织切片厚度为30 μm，以保持脂肪细胞形态。
7. 使用镊子手动揉搓剩余组织。
   注意：组织块也可在10% NBF中固定24–48小时，PBS冲洗后置于70%乙醇中保存，直至进行石蜡包埋。包埋后可切取5 μm切片用于苏木精-伊红（H & E）染色（见下文第2节）。
8. 将MFPs放入6 cm培养皿中，加入5 mL 0.02%胰蛋白酶/0.05% EDTA溶液，37 °C孵育1小时。放入培养箱前，需用70%乙醇喷洒并擦拭培养皿表面。
9. 使用0.7 mm滤网，将去离子水（DI水）倒在组织上冲洗三次。每次冲洗之间使用镊子手动揉搓组织。
10. 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织和适当大小的搅拌子放入已高压灭菌的烧杯中，每1 g组织加入60 mL 3% t-辛基苯基聚氧乙烯醚（参见 材料表），室温搅拌1小时。使用量不少于20 mL。
11. 将组织及溶液倒入滤网中。用 DI 水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上，重复两次。每次冲洗之间使用镊子手动揉搓组织。
12. 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织和搅拌子放回同一烧杯中，每1 g组织加入60 mL 4%脱氧胆酸溶液，室温搅拌1小时。使用量不少于20 mL。
13. 将组织及溶液倒入网筛中。用DI水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上，重复两次。每次冲洗之间使用镊子手动揉搓组织。
14. 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。
15. 将组织放回同一烧杯中，加入新鲜DI水并添加1%青霉素-链霉素，用封口膜密封，4 °C过夜孵育。
16. 清洗滤网和烧杯，以备次日使用。
17. 在 第2天，将烧杯内容物倒入滤网中。用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。
18. 将MFPs放回同一烧杯中，加入适当大小的搅拌子，每1 g组织加入60 mL 4%乙醇/0.1%过氧乙酸溶液（使用量不少于20 mL），室温搅拌2小时。
19. 将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中，使用镊子手动揉搓组织，然后将内容物倒回烧杯。每1 g组织加入60 mL 1× PBS覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌15分钟，重复一次。
20. 将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中，使用镊子手动揉搓组织，然后将内容物倒回烧杯。每1 g组织加入60 mL DI水覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌15分钟，重复一次。
21. 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织及溶液倒入滤网中，使用镊子手动揉搓组织。
22. 将内容物倒回烧杯中，每1 g组织加入60 mL 100%正丙醇覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌1小时。
23. 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中，使用镊子手动揉搓组织。
24. 将内容物倒回烧杯中，每1 g组织加入60 mL DI水覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌15分钟，重复三次。
25. 将组织及溶液倒入滤网中。重复步骤2.3–2.6，以收集用于蔗糖孵育及在冷冻切片包埋介质中冷冻的组织块。
26. 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重，放入已标记的15 mL离心管中，-80 °C冷冻过夜。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林，带旋塞立方容器	VWR	16004-128
2-甲基丁烷	Alfa Aesar	19387
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A1933-25G
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571	恒冷箱切片包埋介质
Kimtech Science Kimwipes 擦拭纸	Kimberly Clark		精细操作擦拭纸
正丙醇（无过氧化物/测序级），Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X)，pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	磷酸盐缓冲液
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
过氧乙酸	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	辛基苯基聚氧乙烯醚
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series 苏木精 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman 定性滤纸，4号规格	Whatman	1004-110	4号定性滤纸
二甲苯（符合ACS认证），Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5