$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 脱细胞化
注意：本方案改编自先前发表的脂肪脱细胞方法，该方法采用离子型去污剂脱氧胆酸钠而非十二烷基硫酸钠，以有效去除DNA。
- 在 第1天，从-80 °C取出冷冻的乳腺脂肪垫（Mammary Fat pads，MFPs），室温下解冻。
- 解冻后，用无尘纸短暂吸干MFPs表面液体，使用分析天平称重。
- 使用镊子配合剪刀或手术刀，将组织切成3 mm × 3 mm × 3 mm的样本，用于完整细胞外基质（ECM）研究，其余组织用于水凝胶制备。
注意：样本数量取决于检测方法的数量，例如下文描述采集两个样本：一个用于石蜡包埋（步骤1.5），另一个（如需要）用于在冷冻切片包埋介质中冷冻（参见 材料表 及步骤1.6）。
- 称量组织。若计划进行石蜡包埋切片，请继续步骤1.5；若计划在冷冻切片包埋介质中冷冻切片，请继续步骤1.6。
- 在化学通风橱中，将组织浸入10%中性缓冲福尔马林（NBF）（参见 材料表）中，4 °C固定24小时。用PBS洗涤3次，每次5分钟。再将组织浸入30%蔗糖溶液中，4 °C孵育48小时。
- 在该组织块取出后立即称重，继续进行步骤1.6。
- 在化学通风橱中，将MFP组织块放入已标记的、装有冷冻切片包埋介质的包埋盒中，加入足量包埋介质完全覆盖组织。
- 将包埋盒放入盛有2-甲基丁烷（参见 材料表）的烧杯中，该烧杯需预先用液氮冷却。烧杯中2-甲基丁烷的量应足以覆盖底部，但不足以淹没包埋盒，以避免冷冻切片包埋介质直接接触2-甲基丁烷。将包埋盒置于2-甲基丁烷中，直至包埋介质完全冻结并变为不透明。
- 用铝箔包裹包埋盒，标记后于-80 °C保存，待后续切片使用。
注意：直接放入冷冻切片包埋介质的组织切片厚度为5 μm，而经蔗糖孵育的组织切片厚度为30 μm，以保持脂肪细胞形态。
- 使用镊子手动揉搓剩余组织。
注意：组织块也可在10% NBF中固定24–48小时，PBS冲洗后置于70%乙醇中保存，直至进行石蜡包埋。包埋后可切取5 μm切片用于苏木精-伊红（H & E）染色（见下文第2节）。
- 将MFPs放入6 cm培养皿中，加入5 mL 0.02%胰蛋白酶/0.05% EDTA溶液，37 °C孵育1小时。放入培养箱前，需用70%乙醇喷洒并擦拭培养皿表面。
- 使用0.7 mm滤网，将去离子水（DI水）倒在组织上冲洗三次。每次冲洗之间使用镊子手动揉搓组织。
- 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织和适当大小的搅拌子放入已高压灭菌的烧杯中，每1 g组织加入60 mL 3% t-辛基苯基聚氧乙烯醚（参见 材料表），室温搅拌1小时。使用量不少于20 mL。
- 将组织及溶液倒入滤网中。用 DI 水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上，重复两次。每次冲洗之间使用镊子手动揉搓组织。
- 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织和搅拌子放回同一烧杯中，每1 g组织加入60 mL 4%脱氧胆酸溶液，室温搅拌1小时。使用量不少于20 mL。
- 将组织及溶液倒入网筛中。用DI水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上，重复两次。每次冲洗之间使用镊子手动揉搓组织。
- 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。
- 将组织放回同一烧杯中，加入新鲜DI水并添加1%青霉素-链霉素，用封口膜密封，4 °C过夜孵育。
- 清洗滤网和烧杯，以备次日使用。
- 在 第2天，将烧杯内容物倒入滤网中。用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。
- 将MFPs放回同一烧杯中，加入适当大小的搅拌子，每1 g组织加入60 mL 4%乙醇/0.1%过氧乙酸溶液（使用量不少于20 mL），室温搅拌2小时。
- 将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中，使用镊子手动揉搓组织，然后将内容物倒回烧杯。每1 g组织加入60 mL 1× PBS覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌15分钟，重复一次。
- 将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中，使用镊子手动揉搓组织，然后将内容物倒回烧杯。每1 g组织加入60 mL DI水覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌15分钟，重复一次。
- 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织及溶液倒入滤网中，使用镊子手动揉搓组织。
- 将内容物倒回烧杯中，每1 g组织加入60 mL 100%正丙醇覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌1小时。
- 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重。将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中，使用镊子手动揉搓组织。
- 将内容物倒回烧杯中，每1 g组织加入60 mL DI水覆盖组织（使用量不少于20 mL），室温搅拌15分钟，重复三次。
- 将组织及溶液倒入滤网中。重复步骤2.3–2.6，以收集用于蔗糖孵育及在冷冻切片包埋介质中冷冻的组织块。
- 用无尘纸短暂吸干组织表面液体并称重，放入已标记的15 mL离心管中，-80 °C冷冻过夜。