肺腺癌移植：一种将癌细胞植入小鼠肺部的方法

摘要

来源：Stevens, L.E. 等，使用博来霉素预处理小鼠气道可提高原位肺癌细胞移植效率。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种通过使用诱导纤维化的试剂——博来霉素预处理气道，将肺腺癌细胞移植到小鼠肺部的方法。该方法显著增强了肺癌细胞在小鼠肺部的原位移植效果。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 博来霉素处理

1. 计划在肿瘤细胞移植前14天对小鼠进行气管内注射博来霉素。
2. 注射前2小时将博来霉素储备液置于冰上解冻。
3. 解冻后，将博来霉素稀释至所需的工作浓度（0.02 U/50 µL 或 0.005 U/50 µL），并保持在冰上。
   注意：博来霉素的浓度取决于实验所用的小鼠品系（见表1）。应通过滴定确定小鼠中博来霉素的最佳剂量。
4. 通过将氯胺酮和赛拉嗪稀释至终浓度分别为10 mg/mL和1 mg/mL来配制麻醉剂。使用1 mL注射器和27 G针头，按氯胺酮/赛拉嗪100/10 mg/kg的剂量对每只小鼠进行腹腔注射麻醉。
5. 监测小鼠呼吸，并进行足趾夹捏测试。当小鼠对足趾夹捏无反应时，确认麻醉成功。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
6. 每次将一只小鼠放置在插管平台上，使其前牙钩住平台边缘，背部紧贴平台。
7. 使用光纤光源照射小鼠上胸部，以帮助可视化气管。打开小鼠口腔，并用无菌平头镊子轻轻拉出舌头。
8. 使用无针头的静脉导管以避免阻塞呼吸。将导管置于气管开口处发出的白光上方进行定位。
9. 将导管插入气管，直至导管顶端到达前牙位置。通过观察导管开口在口腔内透出白光，确认导管已正确置于气管内。
10.  使用移液器将50 µL博来霉素或对照溶剂（PBS）直接注入导管中，确保全部液体被吸入。此步骤应在无菌条件下进行。
11. 若导管插入正确，小鼠会立即吸入导管内的液体。等待数秒，直至全部液体进入气管。随后将导管从气管中取出，并放入10%次氯酸钠溶液中处理。
    注意：步骤1.7至1.11每只小鼠平均耗时约5分钟。
12. 如果小鼠未吸入液体，需密切观察其呼吸，并调整导管位置。若小鼠呼吸停止，应立即移除导管，待其恢复正常呼吸后再重新插入。
13. 将注射后的小鼠仰卧于经IACUC批准的加热垫上，在平坦表面上进行恢复。整个操作过程每只小鼠约需10分钟。在动物完全恢复前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。
14. 在笼子上放置一张"正在使用危险化学品"警示卡，持续24小时。

2. 肺腺癌细胞系的移植

注意：在注射博来霉素后 14 天进行细胞移植（步骤 1.1）

1. 按照步骤1.3所述的相应培养基，在注射前3天，将细胞在75 cm²培养瓶中静置培养，期间不干扰细胞生长。
   注意：注射当天细胞应达到80%融合度（根据细胞系不同，每个培养瓶中细胞数量约为2-3 × 10⁶）。
2. 用5 mL室温的PBS洗涤生长在75 cm²培养瓶中的细胞。
3. 吸除PBS，向细胞中加入1.5 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育，直至细胞从培养瓶表面脱落（通常为2-5分钟）。
   注意：建议每2分钟通过肉眼观察培养瓶底部或在光学显微镜下检查细胞是否脱落。胰蛋白酶孵育时间不得超过5分钟。
4. 加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基4 mL以中和胰蛋白酶活性。将细胞收集至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心3分钟。
5. 吸除上清液，用5 mL PBS重悬细胞沉淀以洗涤细胞。在室温下以200 × g离心3分钟使细胞成团。重复此步骤1次。
6. 吸除PBS，按每瓶培养瓶加入1.5 mL PBS重悬细胞沉淀。
7. 取50 µL细胞悬液与50 µL台盼蓝混合，使用细胞计数器或血细胞计数板进行细胞计数。
8. 用PBS稀释细胞，制备细胞悬液，使每只小鼠注射50 µL体积中含有1 × 10⁵个细胞（或其他指定数量）。注射前将细胞悬液置于冰上保存。
   注意：为避免细胞悬液不足，建议准备至少两倍于实际所需量的细胞。
9. 将氯胺酮和赛拉嗪稀释至终浓度分别为10 mg/mL和1 mg/mL，以配制麻醉剂。使用1 mL注射器和27 G针头，按100/10 mg/kg剂量对每只小鼠进行腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合液以实施麻醉。
10. 监测小鼠呼吸，并进行足趾夹捏测试。当小鼠对足趾夹捏无反应时，确认已达到适当麻醉深度。在麻醉期间，向小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
11.  每次将一只小鼠放置于插管平台，使其前牙钩住平台边缘，背部紧贴平台。
12. 使用光纤光源照射小鼠上胸部，以帮助观察气管位置。
13.  用P200移液器轻轻重悬细胞，确保细胞不形成团块。打开小鼠口腔，用无菌平头镊子轻轻拉出舌头。
14. 使用已去除针头的静脉导管，以避免阻塞呼吸。将导管置于气管开口处发出的白光上方进行定位。
15.  将导管插入气管，直至导管顶端到达前牙位置。通过观察导管开口在口腔内透出白光，确认导管已正确置于气管内。
16. 使用移液器将50 µL细胞悬液直接注入导管中，确保全部液体被吸入。此操作需在无菌条件下进行。
    注意：若导管插入正确，小鼠会立即吸入导管内的液体。
17. 等待数秒，待全部液体进入气道后，将导管从气管中取出，并丢弃至10%次氯酸钠溶液中。
18.  若小鼠未吸入液体，应密切观察其呼吸情况并调整导管位置。若小鼠呼吸停止，应立即拔出导管，待其恢复正常呼吸后再尝试重新插入。
    注意：步骤2.11至2.18每只小鼠平均耗时约5分钟。
19. 将完成注射的小鼠仰卧置于经IACUC批准的加热垫上，在平坦表面上进行恢复。
    注意：整个操作过程每只小鼠约需10分钟。在动物完全恢复意识前，不得将其放回其他动物群体中。
20. 在成像前，使用电动剃毛器将B6129SF1/J及其他深色毛发小鼠品系的肋骨区域（腹侧和背侧）完全剃毛。
21.  细胞注射后2-3分钟，使用胰岛素针头经眶后静脉注射100 µL荧光素（15 mg/mL）。每次成像时交替使用左、右眼进行注射。
22.  注射后至少等待2分钟，将最多5只小鼠以仰卧位放入动物活体生物发光成像仪中，使用发光成像模式采集腹侧图像。
23. 在控制面板中调整分辨率和灵敏度设置，以检测特定细胞系的发光信号。大多数应用可从以下参数开始：曝光时间3分钟（或信号饱和时设为"自动"），binning=中等（4），F值=1，视野=D，样本高度=1.50。
    注意：若注射成功，可在上胸部区域、单侧肺或双侧肺检测到发光信号。
24. 将小鼠翻转为俯卧位，按上述方法采集背侧图像。
    注意：若细胞注射操作不当，细胞可能聚集在气管入口处或颈部区域。
25. 腹腔注射酮洛芬5 mg/kg以缓解疼痛。
26. 将小鼠放回笼中，并在笼上放置“正在使用BSL-2级病原体”警示卡片。""
27. 插管后立即监测小鼠是否出现呼吸困难，之后每15分钟监测一次，直至小鼠从麻醉中苏醒。在小鼠恢复足够意识以维持俯卧姿势前，不得无人看护。
28. 插管后24小时及之后每周三次检查小鼠是否出现任何发病迹象。
29. 在实验记录本中记录操作日期、动物编号、操作类型、麻醉剂种类以及术后监测的时间和观察结果。
30. 在博来霉素接种后，每两周监测一次小鼠体重减轻、呼吸困难、行为异常以及体况评分<2的情况（可见脊柱分节、可触及背侧骨盆骨骼）。
    注意：患有肺部肿瘤的小鼠可能出现呼吸刺激症状、体重减轻、恶病质和/或死亡。
31. 对于出现严重呼吸困难或体重减轻达15%的小鼠，采用二氧化碳安乐死，或使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉后行颈椎脱臼法处死（如需收集组织样本）。通过触诊呼吸活动确认动物已死亡。

3. 利用生物发光成像监测肿瘤生长

1. 在移植后第3天及之后每周重复对小鼠进行成像。
2. 通过注射氯胺酮/赛拉嗪（如步骤2.4–2.5所述）或吸入2%异氟烷对小鼠进行麻醉。监测小鼠呼吸，并通过脚趾夹捏确认麻醉是否充分。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
3. 使用电动剃毛器，在成像前将B6129SF1/J及其他深色毛发小鼠品系的整个肋部区域（腹侧和背侧）剃毛。
4. 待小鼠进入麻醉状态后，使用胰岛素针头经眶后静脉注射100 µL荧光素（15 mg/mL）。等待2分钟。每次成像时交替使用另一只眼睛进行注射。
5. 将小鼠放入成像仪中，并按照步骤2.22–2.24所述获取背侧和腹侧图像。
6. 成像完成后，将小鼠放回笼中，仰卧于平坦表面上以利于恢复。
   注意： 每5只小鼠为一组，整个操作过程约需5分钟。在小鼠恢复至能够自主维持胸腹卧位意识状态前，不得无人看护。
7. 使用成像仪或生物发光分析软件对图像进行分析。

结果

表1：已测试小鼠品系推荐博来霉素剂量列表。

小鼠品系	细胞系	注射细胞数量	移植率%		p值
			对照溶剂	博来霉素
Athymic	H2030

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
啮齿类动物气管插管支架	Braintree Scientific	RIS-100	推荐用于气管内注射的支架
博来霉素	Sigma	B5507-15UN	警告 健康危害 GHS08
Exel 24G导管	Fisher	1484121	去除针头，用于气管内注射
氯胺酮（Ketaset 注射液 100 mg/mL C3N 10 mL）	Butler Schein	56344	用于小鼠麻醉
赛拉嗪	Butler Schein	33198	用于小鼠麻醉
1 mL 注射器	BD / Fisher	14-823-434	用于腹腔注射
Puralube 兽用眼科软膏	BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC	8897	防止麻醉期间眼睛干燥
MI-150 照明器 150W MI-150	DOLAN-JENNER INDUSTRIES	MI-150 / EEG2823M	用于照亮并可视化气管
Graefe 镊子，2.75（7 cm）长锯齿型	Roboz	RS-5111	用于气管内注射
锥形颈T/C 75 cm² 培养瓶，蓝色瓶盖	Fisher / Corning	353135
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	14190-144
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25200-056
Pipet-Lite 移液器，通用型 SL-200XLS+	METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL	17014411
Countess 自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAX1000
D-荧光素粉末	Perkin Elmer Health Sciences Inc	122799	用于发光成像。用PBS重悬粉末至工作浓度15 mg/mL。避光保存
IVIS Spectrum Xenogen 生物发光成像系统	Perkin Elmer Health Sciences Inc	124262	用于活体生物发光成像
B6129SF1/J 小鼠	Jackson Laboratories	101043
NIH-H2030 细胞	ATCC	CRL-5914
PC9 细胞	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62
Living Image 软件	Perkin Elmer Health Sciences Inc	128113	用于活体生物发光分析